En este protocolo se describen tres métodos: recolectar polen corbicular usando trampas de polen, clasificar el polen por color y acetólisis. Estos métodos se usan comúnmente en estudios relacionados con los polinizadores, como la eficiencia de la polinización, la dinámica de forrajeo de los polinizadores y la calidad y diversidad de la dieta. La captura de polen es una manera fácil de recolectar cantidades masivas de polen de las colonias de abejas.
La clasificación de los gránulos de polen por color es un método asequible para clasificar el polen que requiere poca experiencia, y la acetólisis permite identificar el taxón de la planta asociado con cada color de pellet. Demostrando el procedimiento estarán Ellen Topitzhofer, asistente de investigación de la facultad, y Emily Carson, asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Para comenzar, determine cuándo atrapar el polen de la ubicación deseada del colmenar y seleccione las colonias óptimas de abejas melíferas para atrapar el polen.
Evalúe la fuerza de la colonia contando a los recolectores que regresan a la entrada de la colonia durante dos minutos y luego seleccione las colonias con el mayor número total de recolectores que regresan. Seleccione colmenas con artículos de madera que estén en buenas condiciones, preferiblemente sin entradas adicionales y tapas deformadas. Use colonias con menos entradas alternativas, ya que las abejas recolectoras que regresan a tales colonias tienen más probabilidades de reorientarse hacia la entrada de la trampa.
Seleccione entradas de colmenas orientadas al sur siempre que sea posible. Si las colmenas están paletizadas, instale trampas de polen en cada colonia que mire en la misma dirección en una plataforma dada para evitar la deriva de los recolectores hacia las entradas de la colmena vecina. Si lo desea, evalúe el nido de cría de la colonia inspeccionando los marcos para detectar la presencia de larvas y seleccione colonias con cantidades relativamente grandes de larvas.
A continuación, instale trampas de polen en las colonias de abejas seleccionadas. Para trampas de montaje frontal, fije la trampa frente a la entrada con grapas, tornillos y cinta adhesiva, o conecte la trampa a cuerdas elásticas envueltas alrededor de la colmena. Selle todas las demás entradas posibles a la colonia con un material no adhesivo y moldeable, como espuma de látex o poliuretano o una tela de hardware número ocho para agujeros de barrena.
Use cinta adhesiva para pequeñas grietas. Si usa trampas de montaje frontal que se encuentran en colmenas a nivel del suelo, coloque una barrera como una estera de goma entre la canasta de recolección y el césped para evitar daños por humedad del rocío. Activar el mecanismo de captura de la trampa de polen 24 horas después de la instalación y antes de que comience el vuelo de forrajeo del día.
Recoja el polen corbicular particular de la bandeja de recolección y colóquelo en bolsas de plástico o tubos de centrífuga, luego guárdelo en una hielera con hielo. Use la cuchara o una cuchara grande para sacar 10 gramos de polen como una submuestra representativa. Retire todas las partes y desechos de abejas de la submuestra, luego clasifique cada pellet de polen de la submuestra de 10 gramos en un grupo de colores utilizando tanto el color como la textura del polen para diferenciar entre grupos.
Para asegurar al menos 0.25 gramos de cada grupo de color para los pasos posteriores, coloque cualquier gránulo que no sea lo suficientemente abundante como para formar un grupo de color de al menos 0.25 gramos en un grupo misceláneo. Asigne un nombre a cada grupo de colores individual mediante la Guía de colores Pantone. Pese 0,25 gramos de gránulos de polen de cada grupo de color.
Póngase el EPP apropiado. Luego, agregue lentamente 500 microlitros de ácido ácido glacial a cada tubo de microcentrífuga que contenga 0.25 gramos de polen del grupo de color. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva el polen con un palillo limpio durante 10 a 15 segundos.
Centrifugar la muestra durante tres minutos a 1, 100 veces G, luego decantar el sobrenadante en el vaso de precipitados de residuos ácidos. Para preparar la mezcla de acetólisis, agregue 10.8 mililitros de ácido glacial a la mezcla de acetólisis etiquetada como vaso de precipitados. Luego, agregue lentamente 1, 200 microlitros de ácido sulfúrico concentrado de la solución estándar.
Agregue lentamente 1, 000 microlitros de mezcla de acetólisis a cada tubo y revuelva con un palillo limpio durante 10 a 15 segundos. Coloque las muestras en un bloque de calor precalentado a 80 grados centígrados. Incubar los tubos durante cinco minutos, agitando cada tubo a fondo con un palillo limpio a mitad de la incubación.
Después de la incubación, agregue lentamente 500 microlitros de ácido acético glacial a cada tubo y revuelva con un palillo limpio durante 10 a 15 segundos. Centrifugar las muestras, luego decantar el sobrenadante de cada tubo en el vaso de precipitados de residuos ácidos. Enjuague cada muestra tres veces con agua agregando 1, 000 microlitros de agua destilada a cada tubo y revolviendo con un palillo de dientes limpio.
Centrifugar las muestras y decantar el sobrenadante de los tubos en el vaso de precipitados de bicarbonato de sodio. Luego, repita los enjuagues con agua dos veces más. Agregue 1, 000 microlitros de etanol al 95% del vaso de precipitados de etanol a cada tubo y revuelva con un palillo de dientes limpio.
Luego, centrifugar las muestras y decantar el sobrenadante de los tubos en el vaso de precipitados de desecho de etanol. Mezcle la solución madre de tinción de safranina-O y agregue de 5 a 10 gotas a cada tubo. Revuelva con un palillo de dientes durante 10 a 15 segundos y deje el palillo en el tubo.
Agregue 1, 000 microlitros de etanol al 95% del vaso de precipitados de etanol a cada tubo y revuelva. Después de centrifugar las muestras, decantar el sobrenadante en el vaso de precipitados de residuos de etanol. Agregue de 10 a 15 gotas de glicerina a cada tubo y revuelva el contenido durante 10 a 15 segundos.
Deje los tubos abiertos en la campana extractora para evaporar el etanol durante al menos dos horas a temperatura ambiente. Portaobjetos de microscopio de etiqueta para la identificación del polen. Retire una gota de residuos de polen de un tubo y colóquela en el centro de su portaobjetos de microscopio etiquetado, permitiendo que la gota se propague ligeramente.
Coloque un deslizamiento de cubierta limpio sobre la gota en el portaobjetos y selle el deslizamiento de la cubierta al portaobjetos con esmalte de uñas transparente. Utilizando los métodos descritos, se recolectó polen corbicular, se clasificó por color y se identificaron las fuentes vegetales de cada grupo de color de pellets para evaluar la diversidad de polen. Cada muestra de recolección de polen tenía múltiples grupos de colores distinguibles.
En algunas muestras, los grupos de color del polen contenían tan solo cuatro o cinco gránulos. Sin embargo, la mayoría de los grupos tenían significativamente más, y sirvieron como su propio grupo de color etiquetado para la acetólisis. Después de la acetólisis, se utilizó microscopía de luz de campo brillante para identificar efectivamente cada grupo de color a su rango taxonómico más bajo posible al confirmar las características morfológicas con las de los especímenes de vales recolectados en el área que rodea cada sitio de estudio.
El polen recolectado de las ubicaciones de cultivos de almendras tenía una diversidad de polen relativamente menor que el polen recolectado de otros cultivos, con un promedio de tres colores de pellets en 3.2 taxones de plantas por sitio. El polen clasificado puede analizarse en busca de pesticidas para dilucidar los agroquímicos que se encuentran en las plantas forrajeras de las abejas melíferas, o analizarse para determinar su composición química para determinar su valor nutricional para las abejas. Los resultados de esta investigación proporcionaron información valiosa sobre la diversidad de especies observada en el polen recolectado por las colonias, destacando la diversidad sustancialmente baja de polen recolectado en los sistemas de cultivo de almendras.
