이 프로토콜은 역사적으로 일반적인 유전 공학 기술을 사용하여 변환하기 어려웠던 Anopheles 감비아에 대한 특정 미세 주입 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 안정적으로 형질전환 Anopheles 감비아를 생성한다는 것입니다. 이 기술의 응용 프로그램은 인구 억제 또는 야생 형 Anopheles 감비아 인구의 수정에 적합한 모기의 생성을 촉진하여 말라리아 제거를위한 새로운 전략으로 확장.
이 방법론은 다른 모기 종에 쉽게 적응할 수 있습니다. 우리의 미세 주입 기술은 인내와 연습을합니다. 학습 곡선이 있습니다.
시작하려면, 투명 50 밀리리터 원판 튜브에 20 ~30 여성을 배치하는 아스피레이터를 사용합니다. 튜브가 양쪽 끝에서 열리고 한쪽 끝에 라텍스 치과 필름으로 덮여 있는지 확인하고 다른 쪽 끝에는 나일론 메쉬와 필터 종이로 덮여 모기가 알을 낳습니다. 모기가 가득한 튜브를 이중 증류수로 채워진 작은 페트리 접시에 넣고 튜브와 접시를 섭씨 28도에서 45분간 인큐베이터에 놓습니다.
인큐베이터에서 튜브를 제거하고 튜브를 빈 케이지에 삽입합니다. 튜브를 부드럽게 탭하여 모기가 날아갈 수 있도록 합니다. 모든 모기가 날아 오면 케이지에서 튜브를 제거하십시오.
튜브가 모기가 없는 경우, 바닥 고리를 풀고 나일론을 제거하고 집게를 사용하여 튜브에서 계란이 있는 필터 용지를 조심스럽게 제거합니다. 달걀이 담긴 필터 용지를 물로 적신 필터 종이 층이 들어 있는 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 멤브레인을 넣고 깨끗한 집게를 사용하여 멤브레인 필터 조각으로 멤브레인을 덮어 멤브레인 필터의 약 1 밀리미터를 발견합니다.
필터 용지를 탈이온된 물로 적은 다음 브러시를 사용하여 30~50개의 배아를 막 가장자리로 부드럽게 옮기고 멤브레인을 따라 알을 수직으로 정렬합니다. 알이 미세 주입 현미경으로 관찰될 때, 후방 끝이 다운 위치에 있고 바늘로 15도의 각도를 형성할 수 있도록 같은 방향으로 계란을 오리엔테이션합니다. 멤브레인의 가장자리 전체를 계란으로 정렬합니다.
마이크로 로더 팁을 사용하여 DNA 혼합물의 두 마이크로 리터로 바늘을 채웁니다. 바늘 홀더에 바늘을 삽입하고 자동 압력 펌프 튜브를 연결합니다. 바늘을 정렬하여 슬라이드의 평면과 15도 각도를 만듭니다.
첫 번째 달걀을 조심스럽게 만져 바늘 끝을 열고 바늘 끝을 후방 극에 약 10 마이크로미터로 삽입합니다. 성공적인 주사는 계란 내의 세포질의 작은 운동으로 이끌어 낼 것입니다. 현미경 동축 단계 컨트롤을 사용하여 다음 계란으로 이동하여 주사를 계속하십시오.
바늘 끝이 열려 있고 막히지 않았는지 확인하기 위해 다른 배아에 들어가기 전에 주입 버튼을 누르고 바늘의 개구부에서 작은 물방울을 시각화하십시오. 바늘이 막히면 클리어 버튼을 눌러 바늘을 지우고 물방울 시각화 테스트를 반복합니다. 바늘 팁 개구부가 약간 커지면 필요에 따라 압력을 조정하여 액적 크기가 작게 유지되도록 합니다.
바늘 한 개에 약 40~50개의 알을 주입합니다. 주사가 완료되면 계란을 필터 종이로 늘어선 유리 용기에 헹구고 50 밀리리터의 탈온화 된 물로 채워집니다. 이 프로토콜을 사용하여, 자율 적인 유전자 구동 시스템은 Anopheles 감비아의 실험실 긴장 G3의 세균성으로 삽입되었습니다.
이 시스템은 이 종의 세 번째 염색체에 대한 추기경 직교 또는 Agcd를 대상으로 설계되었습니다. 플라스미드 pCO37이 표시됩니다. 그것은 나노 유전자 직교의 조절 원소의 통제하에 연쇄상 구균 pyogenes Cas9 endonuclease를 포함합니다.
또한, U6 유전자 프로모터와 3XP3 CFP 지배적인 마커 카세트의 제어하에 시안 형광 단백질을 발현하는 가이드 RNA를 갖는다. 분자 접근법은 AgNosCd-1로 지정된 약 10킬로그램의 기본 쌍의 DNA를 정확한 삽입을 검증했습니다. 광범위한 후속 분석은 AgNosCd-1이 드라이브에서 매우 효율적이며, 몇 가지 내성 알레를 만들었으며, 유전자 구동 시스템의 통합 및 발현으로 인해 주요 유전 적하가 없는 것으로 나타났습니다.
모기를 포함하는 Homozygous 유전자 드라이브는 유충, 강아지 및 홍눈 표현형을 가진 새로 나타난 성인을 가진 기능의 손실 돌연변이물이었습니다. 이 프로토콜을 시도 할 때, 88에서 유지하는 것은 밝은 회색 계란과 흰 계란을 피하기 위해 좋은 부화에 매우 중요합니다.
