Этот протокол важен, потому что он обеспечивает специфический метод микроинъекции для Anopheles gambiae, который исторически было трудно преобразовать с использованием общих методов генной инженерии. Основным преимуществом данной методики является то, что она надежно создает трансгенные Anopheles gambiae. Применение этого метода распространяется на новые стратегии элиминации малярии, способствуя созданию комаров, пригодных для подавления популяции или модификации популяций Anopheles gambiae дикого типа.
Эта методология может быть легко адаптирована к различным видам комаров. Наша технология микроинъекции требует терпения и практики. Существует кривая обучения.
Для начала используйте аспиратор, чтобы поместить от 20 до 30 самок в прозрачную 50-миллилитровую коническую трубку. Убедитесь, что трубка разрезана с обоих концов и покрыта латексной стоматологической пленкой на одном конце и нейлоновой сеткой и фильтровальной бумагой на другом, где комары будут откладывать яйца. Поместите наполненную комарами трубку в небольшую чашку Петри, наполненную двойной дистиллированной водой, затем поместите трубку и чашку в инкубатор при 28 градусах Цельсия на 45 минут.
Извлеките трубку из инкубатора и вставьте трубку в пустую клетку. Осторожно постучите по трубке, чтобы позволить комарам вылететь. Извлеките трубку из клетки, как только все комары вылетят.
Когда трубка освободится от комаров, открутите нижнее кольцо, удалите нейлон и используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить фильтровальную бумагу с яйцами из трубки. Поместите наполненную яйцами фильтровальную бумагу в пластиковую чашку Петри, содержащую слой фильтровальной бумаги, смоченной водой. Поместите мембрану на чистый стеклянный слайд и используйте чистые щипцы, чтобы покрыть мембрану куском фильтровальной бумаги, оставив около одного миллиметра мембранного фильтра непокрытым.
Смочите фильтровальную бумагу деионизированной водой, затем с помощью щетки аккуратно перенесите от 30 до 50 эмбрионов к краю мембраны и выровняйте яйца вертикально вдоль мембраны. Ориентируйте яйца в том же направлении так, чтобы при наблюдении яиц под микроскопом микроинъекции задний конец находился в положении вниз и образовывал угол в 15 градусов с иглой. Выровнять весь край мембраны яйцами.
Используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы заполнить иглы двумя микролитрами смеси ДНК. Вставьте иглу в держатель иглы и подключите автоматическую трубку напорного насоса. Выровняйте иглу так, чтобы она составляла угол 15 градусов к плоскости слайда.
Откройте кончик иглы, осторожно коснувшись первого яйца, затем вставьте кончик иглы примерно на 10 микрометров в задний полюс. Успешная инъекция приведет к небольшому движению цитоплазмы внутри яйцеклетки. Используйте контроль коаксиальной стадии микроскопа, чтобы перейти к следующей яйцеклетке, чтобы продолжить инъекцию.
Чтобы убедиться, что кончик иглы остается открытым и не засоряется, нажмите кнопку «Ввести» перед введением другого эмбриона и визуализируйте маленькую каплю в отверстии иглы. Если игла засоряется, нажмите кнопку Clear, чтобы очистить иглу, и повторите тест визуализации капель. Отрегулируйте давление по мере необходимости, если отверстие наконечника иглы становится немного больше, чтобы размер капли оставался небольшим.
Вводят от 40 до 50 яиц одной иглой. После того, как инъекции будут завершены, промойте яйца в стеклянном контейнере, выстланном фильтровальной бумагой и заполненном 50 миллилитрами деионизированной воды. Используя этот протокол, автономная генно-управляемая система была вставлена в зародышевую линию лабораторного штамма G3 Anopheles gambiae.
Система была разработана для нацеливания на кардинальный ортолог, или Agcd, на третьей хромосоме у этого вида. Показана плазмида pCO37. Он содержит эндонуклеазу Streptococcus pyogenes Cas9 под контролем регуляторных элементов ортолога гена nanos.
Кроме того, он имеет направляющую РНК под контролем промотора гена U6 и доминантную маркерную кассету 3XP3 CFP, экспрессирующую голубой флуоресцентный белок. Молекулярные подходы подтвердили точную вставку около 10 килограммовых пар оснований ДНК, которая была обозначена как AgNosCd-1. Обширные последующие анализы показали, что AgNosCd-1 был очень эффективен при движении, создавал мало устойчивых аллелей и не имел серьезной генетической нагрузки из-за интеграции и экспрессии системы генного драйва.
Гомозиготный генный драйв, содержащий комаров, был мутантами с потерей функции, причем личинки, куколки и недавно появившиеся взрослые особи имели фенотип красных глаз. При попытке этого протокола поддержание 88 имеет решающее значение для хорошего вылупления, чтобы светло-серые яйца и избегать белых яиц.
