Este protocolo é significativo porque fornece um método específico de microinjeção para um Anopheles gambiae, que tem sido historicamente difícil de transformar usando técnicas comuns de engenharia genética. A principal vantagem dessa técnica é que ela cria de forma confiável Anopheles gambiae transgênica. As aplicações dessa técnica se estendem a novas estratégias para a eliminação da malária, facilitando a criação de mosquitos adequados para supressão populacional ou modificação de populações de anofeeles gâmbias do tipo selvagem.
Essa metodologia pode ser adaptada facilmente a diferentes espécies de mosquitos. Nossa tecnologia de microinjeção tem paciência e prática. Há uma curva de aprendizado.
Para começar, use um aspirador para colocar de 20 a 30 fêmeas em um tubo cônico transparente de 50 mililitros. Certifique-se de que o tubo é aberto em ambas as extremidades e é coberto com filme dental de látex em uma extremidade e malha de nylon e papel filtro na outra, onde os mosquitos colocarão seus ovos. Coloque o tubo cheio de mosquitos em uma pequena placa de Petri cheia de água dupla destilada, em seguida, coloque o tubo e a placa em uma incubadora a 28 graus Celsius por 45 minutos.
Retire o tubo da incubadora e insira o tubo em uma gaiola vazia. Bata suavemente no tubo para permitir que os mosquitos voem para fora. Remova o tubo da gaiola assim que todos os mosquitos tiverem voado para fora.
Quando o tubo estiver livre de mosquitos, desaparafusar o anel inferior, remover o nylon e usar fórceps para remover cuidadosamente o papel filtro com os ovos do tubo. Coloque o papel filtro carregado de ovos em uma placa de Petri de plástico contendo uma camada de papel filtro umedecido com água. Coloque uma membrana em uma lâmina de vidro limpa e use fórceps limpos para cobrir a membrana com um pedaço de papel filtro, deixando cerca de um milímetro do filtro de membrana descoberto.
Molhe o papel filtro com água deionizada, em seguida, use a escova para transferir suavemente 30 a 50 embriões para a borda da membrana e alinhar os ovos verticalmente ao longo da membrana. Oriente os ovos na mesma direção para que quando os ovos são observados sob o microscópio de microinjeção, a extremidade posterior esteja em posição de baixa e forme um ângulo de 15 graus com a agulha. Fore toda a borda da membrana com ovos.
Use uma ponta de microcarregador para encher as agulhas com dois microliters de mistura de DNA. Insira a agulha no suporte da agulha e conecte o tubo automatizado da bomba de pressão. Alinhe a agulha para que ela faça um ângulo de 15 graus com o plano do slide.
Abra a ponta da agulha tocando cuidadosamente o primeiro ovo, depois insira a ponta da agulha em cerca de 10 micrômetros no poste posterior. Uma injeção bem sucedida levará a um pequeno movimento do citoplasma dentro do ovo. Use os controles de estágio coaxial do microscópio para mover-se para o próximo ovo para continuar a injeção.
Para garantir que a ponta da agulha permaneça aberta e não tenha sido entupida, pressione o botão Injetar antes de inserir outro embrião e visualize a pequena gota na abertura da agulha. Se a agulha ficar entupida, pressione o botão Limpar para limpar a agulha e repetir o teste de visualização de gotículas. Ajuste a pressão conforme necessário se a abertura da ponta da agulha ficar um pouco maior para garantir que o tamanho da gota permaneça pequeno.
Injete cerca de 40 a 50 ovos com uma agulha. Após as injeções estarem completas, enxágue os ovos em um recipiente de vidro forrado com papel filtro e preenchido com 50 mililitros de água deionizada. Usando este protocolo, um sistema autônomo movido a genes foi inserido na germinação de uma cepa de laboratório G3 de Anopheles gambiae.
O sistema foi projetado para atingir o ortolog cardeal, ou Agcd, no terceiro cromossomo desta espécie. O plasmid pCO37 é mostrado. Contém Streptococcus pyogenes Cas9 endonuclease sob controle dos elementos regulatórios do ortolog genético nanos.
Além disso, possui um RNA guia sob o controle de um promotor genético U6 e o marcador dominante 3XP3 CFP expressando a proteína fluorescente ciano. Abordagens moleculares verificaram a inserção precisa de cerca de 10 kg de pares de base de DNA, que foi designado como AgNosCd-1. Extensas análises de acompanhamento mostraram que o AgNosCd-1 era altamente eficiente na unidade, criava poucos alelos resistentes e não tinha carga genética importante devido à integração e expressão do sistema de acionamento genético.
O impulso genético homozigoso contendo mosquitos eram mutantes de perda de função, com larvas, pupas e adultos recém-emergido tendo um fenótipo de olho vermelho. Ao tentar este protocolo, manter-se em 88 é crucial para uma boa eclosão para ovos cinzentos claros e evitar ovos brancos.
