Este protocolo es significativo porque proporciona un método de microinyección específico para un Anopheles gambiae, que ha sido históricamente difícil de transformar utilizando técnicas comunes de ingeniería genética. La principal ventaja de esta técnica es que crea de forma fiable Anopheles gambiae transgénicos. Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia estrategias novedosas para la eliminación de la malaria al facilitar la creación de mosquitos adecuados para la supresión de la población o la modificación de las poblaciones de Anopheles gambiae de tipo silvestre.
Esta metodología se puede adaptar fácilmente a diferentes especies de mosquitos. Nuestra tecnología de microinyección requiere paciencia y práctica. Hay una curva de aprendizaje.
Para comenzar, use un aspirador para colocar de 20 a 30 hembras en un tubo cónico transparente de 50 mililitros. Asegúrese de que el tubo esté abierto en ambos extremos y esté cubierto con película dental de látex en un extremo y malla de nylon y papel de filtro en el otro, donde los mosquitos pondrán sus huevos. Coloque el tubo lleno de mosquitos en una pequeña placa de Petri llena de agua de doble destilación, luego coloque el tubo y el plato en una incubadora a 28 grados centígrados durante 45 minutos.
Retire el tubo de la incubadora e inserte el tubo en una jaula vacía. Golpee suavemente el tubo para permitir que los mosquitos salgan volando. Retire el tubo de la jaula una vez que todos los mosquitos hayan volado.
Cuando el tubo esté libre de mosquitos, desenrosque el anillo inferior, retire el nylon y use fórceps para quitar cuidadosamente el papel de filtro con los huevos del tubo. Coloque el papel de filtro cargado de huevos en una placa de Petri de plástico que contenga una capa de papel de filtro humedecida con agua. Coloque una membrana en un portaobjetos de vidrio limpio y use pinzas limpias para cubrir la membrana con un trozo de papel de filtro, dejando aproximadamente un milímetro del filtro de membrana descubierto.
Humedezca el papel de filtro con agua desionizada, luego use el cepillo para transferir suavemente de 30 a 50 embriones al borde de la membrana y alinee los huevos verticalmente a lo largo de la membrana. Oriente los óvulos en la misma dirección para que cuando se observen los óvulos bajo el microscopio de microinyección, el extremo posterior esté en una posición hacia abajo y forme un ángulo de 15 grados con la aguja. Forrar todo el borde de la membrana con huevos.
Use una punta de microcargador para llenar las agujas con dos microlitros de mezcla de ADN. Inserte la aguja en el soporte de la aguja y conecte el tubo de la bomba de presión automatizada. Alinee la aguja para que haga un ángulo de 15 grados con el plano de la diapositiva.
Abra la punta de la aguja tocando cuidadosamente el primer huevo, luego inserte la punta de la aguja a unos 10 micrómetros en el polo posterior. Una inyección exitosa conducirá a un pequeño movimiento del citoplasma dentro del óvulo. Use los controles de la etapa coaxial del microscopio para pasar al siguiente óvulo para continuar la inyección.
Para asegurarse de que la punta de la aguja permanezca abierta y no se haya obstruido, presione el botón Inyectar antes de ingresar a otro embrión y visualice la pequeña gota en la abertura de la aguja. Si la aguja se obstruye, presione el botón Borrar para limpiar la aguja y repita la prueba de visualización de gotas. Ajuste la presión según sea necesario si la abertura de la punta de la aguja se hace un poco más grande para asegurarse de que el tamaño de la gota permanezca pequeño.
Inyecte alrededor de 40 a 50 huevos con una aguja. Después de que se completen las inyecciones, enjuague los huevos en un recipiente de vidrio forrado con papel de filtro y lleno con 50 mililitros de agua desionizada. Usando este protocolo, se insertó un sistema autónomo impulsado por genes en la línea germinal de una cepa de laboratorio G3 de Anopheles gambiae.
El sistema fue diseñado para apuntar al ortólogo cardinal, o Agcd, en el tercer cromosoma de esta especie. Se muestra el plásmido pCO37. Contiene Streptococcus pyogenes Cas9 endonucleasa bajo control de los elementos reguladores del gen nanos ortholog.
Además, tiene un ARN guía bajo el control de un promotor del gen U6 y el casete de marcador dominante 3XP3 CFP que expresa la proteína fluorescente cian. Los enfoques moleculares verificaron la inserción precisa de pares de bases de ADN de aproximadamente 10 kilos, que se designó como AgNosCd-1. Extensos análisis de seguimiento mostraron que AgNosCd-1 era altamente eficiente en el accionamiento, creaba pocos alelos resistentes y no tenía una carga genética importante debido a la integración y expresión del sistema de impulsor genético.
Los mosquitos que contenían el impulso genético homocigoto eran mutantes de pérdida de función, con larvas, pupas y adultos recién surgidos que tenían un fenotipo de ojos rojos. Al intentar este protocolo, mantenerse a los 88 años es crucial para una buena eclosión de los huevos de color gris claro y evitar los huevos blancos.
