本SEMイメージングプロトコルは、インビトロで細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および大尖頭カップを視覚化および定量化するためのツールを提供する。SEMは、大ピノサイト膜活性を視覚化するために使用できる細胞表面の高解像度画像を提供する。この技術は、マクロピノサイトーシスを調節する新しいシグナル伝達経路を発見し、ミクロピノサイトーシスの新規刺激因子および阻害剤を同定するために使用することができる。
まず、オートクレーブ処理された鉗子を使用して、滅菌ガラスカバースリップを24ウェルプレートのウェルに配置します。次いで、生の264.7マクロファージをカバー上に播種し、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の密度でスリップし、プレートを摂氏37度および二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。翌日、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全培地と交換し、DMSOなどのビヒクルコントロールまたはEIPAなどのマクロピノサイトーシス阻害剤でマクロファージを30分間前処理します。
次に、膜フリルを促進するために、1マイクロモルPMA溶液または1ミリリットル当たり100ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子などのマクロピノサイトーシス刺激剤で細胞を30分間処理する。走査型電子顕微鏡観察のために細胞を固定するには、ウェルから培地を吸引し、カバースリップを氷冷PBSで2回洗浄し、次いでカバースリップを固定液中で室温で30分間インキュベートした後、摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、細胞単層を乱すことなく、静かに洗浄し、次いでカバースリップを500マイクロリットルの0.1モーターカコジル酸ナトリウム中で15分間インキュベートする。
500マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄した後、各洗浄で10分間インキュベーションしながら、500マイクロリットルの段階的エタノールシリーズでカバースリップを2回洗浄する。臨界点乾燥を行うには、カバースリップを臨界点乾燥機に入れ、100%エタノールで覆います。次に、電源ボタンを押して二酸化炭素タンクを開きます。
温度が摂氏0度まで下がるまで、冷却ボタンを約30秒間押します。次に、チャンバーウィンドウにバブルが表示されるまで塗りつぶしボタンを押します。次に、パージ排気からのエタノールの臭いが消えるまでパージボタンを押します。
次に、温度が摂氏0度まで下がるまで冷却ボタンをもう一度押します。フルボタンとパージボタンをもう一度押して、電源を切ります。その後、二酸化炭素タンクを閉じます。
冷却底部を押し直して電源を切り、ヒートボタンを押します。温度を摂氏 42 度に、圧力を 1,200 ポンド/平方インチに設定します。圧力と温度が安定したら、ブリードボタンを押して圧力をゆっくりと下げます。
チャンバーの圧力が1平方インチあたり150ポンドに達したら、通気口の底部を押し、圧力が1平方インチあたりゼロポンドに低下するまで待ちます。臨界点乾燥機の電源を切り、カバースリップを取り外します。次に、カーボン接着剤タップを用いて、走査型電子顕微鏡観察用のアルミニウム試験片マウントにカバースリップを装着し、スパッタコーターで金またはパラジウムを用いたスパッタ塗布に進む。
スパッタコーターの電源ボタンをオンにします。真空が30ミリトルに達したら、チャンバーをフラッシュしてガススイッチをオフにし、細かいガスバルブを反時計回りに回して湿度と空気を除去します。真空が200ミリトルに上昇したら、ガススイッチをオフにして、真空が30ミリトルに達するまで待ちます。
その後、チャンバーを再びフラッシュして、実証したように湿度と空気を除去します。チャンバーを3回フラッシュした後、タイマーの底部を押し、ゲージが10ミリアンペアを読み取るまで電圧ノブを調整します。次に、コーティングされたカバースリップをチャンバーから取り外します。
メンブレンフリルを視覚化して定量化するには、サンプルカバースリップを走査型電子顕微鏡のチャンバーに挿入し、ドアを閉じ、evacボタンを押します。顕微鏡操作ソフトウェアを開き、加速電圧を15キロボルト、作動距離を10ミリメートルに設定します。[座標] ボタンを押し、セルが観測画面の中央に表示されるまでコントローラーの周りを移動します。
倍率を 3, 500 X に設定し、[写真] ボタンをクリックしてサンプルを画像化します。ここに示されているのは、PMAおよびマクロファージコロニー刺激因子による処理後の生264.7マクロファージにおける膜フリル形成を実証する代表的な走査型電子顕微鏡像である。マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによるマクロファージの前処理は、膜フリル形成を減弱させる。
フリル形成の間、原形質膜は、シート状の膜突起、C字型膜フリル、および大ピノシティックカップを含む別個の形態学的段階を経る。PMAおよびマクロファージコロニー刺激因子処理後の膜ラッフル形成は、走査型電子顕微鏡を用いて定量化することができるが、一方、マクロピノソーム形成は、テキサスレッドデキストランおよびFM4−64を用いた共焦点顕微鏡などの代替イメージング技術によって確認することができる。青い矢印は膜のフリルを示し、黄色と緑の矢印はマイクロピノソームを指しています。
最後に、マクロピノサイトーシスは、FITCまたはテキサスレッドデキストランなどの蛍光流体相マーカーを用いたフローサイトメトリーを通じて確認および定量することができる。SEMに加えて、蛍光標識デキストランインターナリゼーションの生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー分析も、マクロピノサイトーシスを調査および定量するために行うことができる。
