この作品は、オーストリア科学基金（FWF）助成P18820 - B13によって賄われていた。 倫理のステートメント： 調査は1983年に改訂し、参加しているすべての患者が彼らの書面によるインフォームドコンセントを与えたとして、ヘルシンキのDeclaractionを遵守するザルツブルクの大学のヒトおよび/または動物を伴う実験のために倫理委員会（PLUS_Ethik_090514）承認された。

1。薬物コンジュゲートの調製<ol><li> 1.5 mlの反応チューブに10 mgのDF 1ミリリットルのdH 2 Oに溶解する。さらに先に進むには、このDFのソリューションの95μlを使用してください。 HSAにPPコンジュゲートするには、500μlの0.3 Mの水酸化ナトリウム（NaOH）の30.4 mgをPP誘導体（304 g /モル）を溶​​解する。 </li><li> （N -モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液に溶解したDFの6.5から95μlを- 430.6μLのdH 2 Oと100μlの0.5Mの2を追加。 PPのサンプルに33.1μLのdH 2 Oおよび2 M MES緩衝液pH 2.9の140μlを添加する。 </li><li>新しく調製したN -エチル- N&#39;の57.5μlを加え、 - DFのサンプル〜100 mg / mlの、またはに10μlのEDC溶液の濃度とOのdH 2に溶解した（3 -ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）ストック溶液PPのサンプル。ボルテックスで1分間のサンプル。 </li><li>各サンプル〜118 mg / mlの濃度でHSA溶液の16.9μlを加え。 </li><li> 300ラウンド/分で振とうしながら室温で2時間サンプルをインキュベートする。 </li><li>数時間ごとにDFとPPのサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.4の2リットルに対して3回透析。 4℃で、すべての透析の手順を実行します。 </li><li> 14,000 xgでサンプル10分間遠心し、上清を含むDFまたはHSAに結合したPPを収集する。 </li><li> 12％ゲルを用いて、SDS - PAGEを行うことにより、タンパク質の上清を確認してください。 oneゲルのスロットにHSA抱合体の約12μgをロードします。 </li></ol> 2。薬物複合体の結合率を決定する（図2） <ol><li> HPSECでDFとPPの複合体の結合率の分析のために150mMのNaCl及び0.05％アジ化ナトリウムを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5を使用してください。 7.8 × 300ミリメートルTSK - GEL - G2000 SWXLの列を使用してください。 </li><li>オンライン結合RIとUV検出器システムを使用して信号の検出を行います。 </li><li>のdH 2 O中に1 mg / mlの濃度でHSAの標準サンプルを準備する検出器のキャリブレーションのために50μlのHSAの標準溶液を注入する。 </li><li> RI定数kのRIおよび検出器のためのUV定数kのUVを計算する。式の領域のRIを使用= k個のRI * [（DN / DC）HSA * C（HSA）]とエリアUV = K UV * [（DA / DC）HSA * C（HSA）]と（DN / DC）HSA = 0.185と（DA / DC）HSA = 0.518 5。 </li><li> DFとの両方の規格の5、10、および30 nmol収量を容易に注入できることをHPSEC用PP派生規格を準備します。 </li><li> 薬と両方の規格のための（DA / DC） 薬 （DN / DC）の値を平均計算する。 DFの場合は、39.000の0.235の（DN / DC）± 0.010と（DA / DC）± 0.493を決定した。 PPの場合は、53.155の0.328の（DN / DC）± 0.016と（DA / DC）± 2.464を決定した。 </li><li> HPSECの薬物複合体を注入し、それらのRIとUVピーク面積を決定する。 </li><li> = kのRI * [（DN / DC） 薬 * C（薬）+（DN / DC）HSA * C（HSA）]とエリアのUV二つの方程式の領域のRIを解くことによってDF、PP誘導体、およびHSAの濃度を計算する= K UV * [（DA / DC） 薬 * C（薬）+（DA / DC）HSA * C（HSA）]未知数のため。 </li></ol> 3。薬物複合体を使用してBAT <ol><li> sevenフローサイトメトリーのバイアルを準備し、その内容に応じて、それらにラベルを付ける：未染色のコントロール、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、および薬物複合体を。 </li><li>ピペット染色およびネガティブコントロール用に予約されたバイアルにB - CCR - STBの刺激バッファー（Flow2 CAST、Bühlmann研究所、Schönenbuch、CH）の50μlの。ポジティブコントロールとして、Flow2 CASTキットで提供される抗FcεRI溶液50μlを使用してください。 0.02 -20μg/ mlのDF共役とPP共役（200μlのアッセイ体積中の最終濃度）から1:10希釈系列を作成することにより、薬物複合体のために予約バイアルに共役ソリューションの適切な量を追加。これらの滴定実験は、各患者サンプルに対して最適な好塩基球活性化の濃度を決定するために実行する必要があります。 </li><li>各チューブに、50μlの患者のEDTA全血に100μlの刺激のバッファを追加。慎重にサンプルを混ぜる。 </li><li>ピペット20μlのFlow2 CAST染色コエリスリン（PE）と各チューブにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した抗CD63抗体で標識した抗CCR3抗体を含む試薬、再度混ぜる。未染色標本に染色試薬をピペッティングしないでください！ </li><li> 37℃の水浴中で45分間サンプルをインキュベートする。 </li><li> 5分間氷上で反応を停止します。 </li><li>静かに各バイアルおよび渦に試薬を溶解し2.0ミリリットルFlow2のCASTを追加することにより、赤血球を溶解する。室温で10分間暗所でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 5 500 × gで分間、注意深く上清をデカントのためにサンプルを遠心する。 </li><li>フローサイトメトリーするまで氷上で500μlのFlow2 CASTの洗浄バッファーとストア内の細胞を再懸濁する。 </li><li>フローサイトメーターの電圧sを調整する前方および側方散乱光（FSC、SSC）のためのettings未染色標本を獲得しながら。 </li><li>ゲートのセルは、SSC - FSCのプロットからSSC - PEのプロットへのリンパ球として予測。好塩基球は、CCR3 ハイ SSC LOとゲートそれらのFITC - PEのプロットになど、PE標識抗CCR3抗体によって識別されます。活性化好塩基球を検出する抗CD63抗体は、FITCで標識されている。 </li><li>ネガティブコントロールにおけるCD63 HIと好塩基球の最大カットオフ2.5％を設定します。 &gt; 5％の好塩基球は、CD63 hiおよびネガティブコントロールのMFIで割ったサンプルの平均蛍光インデックス（MFI）2を超える（図3）である場合、サンプルは、好塩基球活性化のために正とみなされます。 </li></ol> 4。代表的な結果： この実験では、IgE依存性の薬物過敏症を検出するために有益なツールとしてBATを評価します。非ステロイド性抗炎症薬の蛋白質複合体は、好塩基球の活性化のために使用されています。 RIとUV検出の凝集状態、結合度、および結合体の効果的な利回りとHPSECによって決定されます。 図4に示すように、DFの複合体の43.5％、5.0 DF / HSAの結合度を持つ単量体であった。凝集体のために9.5の結合度を決定した。 propyphenazone複合体は、21.2の結合度と68.5％のモノマーから成ることが示された。凝集体の結合度は27.9であった。合計では、DFの複合体の決定結合度は7.6 DFとPPの複合体のそれは23.2であった。 BATはNSAID過敏症におけるIgE依存性反応の調査を許可されて最適化された条件下での抱合体（抱合体の濃度、刺激時間）で行う。好塩基球の20.6％が活性化された蛍光強度の対数変化によって特徴づけ： 図5に示すように、唯一のPP複合体は、好塩基球活性化はCD63の表面発現のアップレギュレーションにより視覚誘発することができた。 MFIは1893年に386（ネガティブコントロール）から4.9倍増加した。対照的に、好塩基球のDF共役を使用すると、は3.1％が5％未満にオフカットされた活性化した。また、MFIは197（ネガティブコントロール）から210に係数1.1（上限2.0）でのみ増加した。アッセイの妥当性は、&lt;好塩基球の亜集団の蛍光強度の（ⅱ）ログシフト、および（iii）、陰性対照の5％好塩基球の活性化&gt; 50％活性化好塩基球（陽性対照）（i）で与えられる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> 図1。HSAにDFとPP誘導体のカップリング。溶解後の薬剤、水、MES緩衝液、およびEDC（カップリング試薬）が追加されます。 HSAは、薬剤のソリューションにピペッティングする前にサンプルを1分間ボルテックスしている。室温で振盪しながら2時間以内に薬は共有結合HSAに結合する。モノマーと同様に凝集が発生する可能性があります。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> 図2。結合度の計算。最初に、RIとK UV K定数が決定されます。したがって、既知の濃度のHSAの標準は、HPSECシステムに注入される。 （DN / DC）とHSAの（DA / DC）がそれぞれ5、0.185と0.518の値が与えられます。ピーク面積は、定数を計算するために使用されています。第二に、各薬物のための3つの基準は、薬物と濃度固有のRIとUV領域を決定するために注入されています。 k個のRIとK UVの定数は上記の手順から知られているので、薬剤固有の（DN / DC）と（DA / DC）の誘導体は、計算することができます。第三に、薬剤HSAコンジュゲートは、HPSECに注入されています。結果として得られるピーク面積は、2つの未知変数を持つ2つの方程式を解くことにより、ピークあたりの薬剤とHSAの濃度を計算するために使用されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> 図3。好塩基球のゲーティング。リンパ球は前方散乱対ゲート側方散乱（SSC - FSCプロット）であるため、細胞が予測している。好塩基球は、ゲートリンパ球（SSC - CCR3 - PEプロット）からCCR3 ハイ SSC LOとして識別されます。好塩基球は、CD63 - FITC - CCR3 - PEのプロットの活性化（CD63 HI）について分析する。ネガティブコントロールは、CD63 hiを残りの最大2.5％の好塩基球のカットオフを設定するために使用されます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> 図4。薬物複合体の決定結合度。 RIとUVの信号は、薬物 - HSA複合体の凝集体（低保持容量で溶出）および単量体を（高い保持容量で溶出）を表す2つのピークを示す。単量体と凝集体（RIシグナルから決定）とそれらの結合度のパーセンテージは、（N = 1）描かれています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> 図5。好塩基球activatiテストで。薬物複合体活性化サンプル、ネガティブコントロール、ポジティブコントロールの結果は、CD63 - FITC - CCR3 - PEのプロット（N = 1）で示されています。

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	<li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone.">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li><li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+questions+in+Allergy:+1--drug+allergy/hypersensitivity.">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li><li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils,+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy.">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li><li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diclofenac+hypersensitivity:+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites.">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li><li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering,+absorbance,+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions.">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li><li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tests+based+on+human+basophils:+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues.">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li><li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-assisted+allergy+diagnosis:+current+applications+and+future+perspectives.">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li><li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions:+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils.">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory &#38; Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li><li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

BATは、IgE介在アレルギー性疾患6,7の診断のための十分に確立さまだ日常的に使用されていないが方法です。低分子量化合物が架橋IgE受容体、好塩基球の活性化8の前提条件にできないとして、薬物過敏症の場合は、しかし、その適用性が損なわれます。したがって、調査中の薬は、共有結合適当な担体タンパク質（例えばHSA）に結合する必要があります。重要なことは、結合度（担体タンパクあたりの薬物分子の数など）が抱合体（ すなわち、IgE受容体架橋）免疫学的活性を保証するために制御する必要がある。理論的には、担体分子当たり2つのハプテンは、IgE受容体架橋とHSAあたり5 DFの分子は細胞ベースのアッセイ4のメディエーター遊離を誘発することが示されている限り少ないために十分なはずです。両方の複合体、PP - HSAとDF - HSAは、十分に高い結合度（HPSEC）を表示し、それらのBATの使用に適した試薬making免疫学的にアクティブになるように決定されている。もう一つの問題は、代わりに親薬物の代謝物として、過敏反応を引き起こす可能性、薬物代謝物の役割を果たしていることがあります。 DFの場合には、この可能性は、以前は次の5つの主要なフェーズI代謝一リンケージバリアント4を用いて詳細に評価されている。マスタリング説明する手法のための重要な要因は、血液サンプル（&lt;採血、検出された好塩基球の数から12時間&gt; 500）と刺激条件の最適化（時間、投与量）の質が含まれています。さらに、さらに、ポジティブコントロールと反応しない、いわゆる非応答（IgEレセプターに対する抗体）が同定されている。したがって、検証の基準は、ポジティブコントロールとして抗FcεRI抗体を含める必要があります。薬物複合体を使用しての重要な利点は、彼らがBAT 4の抗FcεRI抗体との共刺激により、DF - HSA抱合体のために示される純粋な薬、とは対照的に非毒性の現れるという事実です。純粋なDFは、対照的に、BAT 9の解釈性の問題を引き起こして1.25 mg / mlの濃度で細胞毒性効果を表示します。一般的に、潜在的な細胞毒性のためのテストを実施することを強くあらゆる新たに生成される薬物複合体のために推奨されます。 ここでは、IgE媒介過敏症を明らかにするためにBATで使用されているPP - HSA抱合体の可能性を示している。対照的に、DF過敏症は、DF - HSA抱合体に反応して好塩基球活性化の欠如によって示されるIgEと関連付けられていません。重要なことは、IgE媒介メカニズムに関する不確実性の場合には、コンジュゲートはDF 4に示されているようにin vitroでの細胞ベースのアッセイシステムでによって免疫学的活性について評価する必要があります。 適切なタンパク質担体分子に共有結合抗生物質、他の非ステロイド性抗炎症薬、造影メディア、筋弛緩薬、麻酔薬等を含む薬剤に対する過敏反応の数を低分子量の薬物を結合の説明に従ってセットアップを使用することを介するIgEの関与を調査することができるメカニズム。したがって、BATは、診断のための既存の方法（皮膚テスト、経口誘発試験）に加えて、として機能することができる。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> 2 - （N -モルホリノ）エタンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7.8 × 300 mmのゲルを、TSK - G2000SWXLコラム</td><td>バイオサイエンス東ソー</td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心機</td><td>シグマ</td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>ジクロフェナクナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA -バキュテイナ</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 CASTキット</td><td> Bühlmann研究所</td><td> FK - CCR </td><td>効果的な2011年6月14日Flow2 CASTキットは現在、フローCASTです。 </td></tr><tr><td> HP1100 HPLCシステム</td><td>ヒューレットパッカード</td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td>実験室の遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N -エチル- N&#39; - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC） </td><td>シグマ</td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBSの錠剤</td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone誘導体</td><td>分子生物学科、ザルツブルク大学、オーストリア</td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>エッペンドルフ</td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>シグマ</td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td>ナトリウム炭酸水素</td><td>シグマ</td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td>ナトリウムhydroxid </td><td>シグマ</td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td>トリプル検出器アレイ</td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td>個人BioVortex V - 1プラス</td><td> Peqlab </td><td> 90 - V - 1 </td><td> - </td></tr><tr><td>水浴1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

propyphenazone（PP）とジクロフェナクのような非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）（DF）に対する過敏性反応は、アレルギー反応1 I -のような形として現れることができます。臨床の現場では、薬剤過敏症の診断は、主に皮膚テストは信頼性と経口誘発試験患者2の生命を脅かすリスクを負担ではないとして、患者の病歴によって実行されます。したがって、基本的なIgEを介する病態のための証拠を得るのは難しいです。 ここで、我々は、in vivoでのアレルギーエフェクター反応を模倣する薬剤過敏患者由来のヒト好塩基球の使用に基づいて、in vitroの方法に存在する。薬剤アレルギー患者の好塩基球は、犯人の薬剤のためのIgE分子が特定運ぶように、彼らは、IgE受容体の架橋によって活性化され、アレルギーのエフェクター分子をリリースとなる。好塩基球の活性化は、フローサイトメトリー3を使用してCD63の表面発現のアップレギュレーションの測定によりモニターすることができます。 低分子量の薬物の場合には、複合体は、好塩基球のIgEレセプターの架橋を可能にするように設計されています。 図1に示すように、非ステロイド性抗炎症薬の代表2名、PPとDFは、共有結合リジン残基の一級アミノ基と反応カルボキシル基を介してヒト血清アルブミン（HSA）にバインドされています。カルボキシル基含有PPの誘導体はorganochemically事前調査1に合成されなければならなかったのに対し、DFは、このように、直接4に使用できる固有のカルボキシル基とを、運びます。 蛋白質の担体分子の低分子量化合物とその空間分布の結合度は、2つのIgE受容体分子の架橋を保証することが重要です。ここで説明するプロトコルは、シーケンシャルな屈折率（RI）と結合度の測定のための紫外線（UV）検出システムを搭載した高性能サイズ排除クロマトグラフィー（HPSEC）が適用されます。 説明される方法は他の薬に適用される場合がありますので、好塩基球活性化テスト（BAT）は、薬物過敏症におけるIgE媒介機構の決定に使用される可能性を負いません。 BATによる非IgE媒介としてここでは、IgEを介するとDF過敏症としてPPの過敏症を決定する。

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Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

好塩基球の活性化の試験は、IgE依存性のアレルギーを検出するための強力なツールです。<em&gt; in vitroで</em&gt;。ここでは、好塩基球の活性化のテスト用に最適化されたプロトコルは、薬物過敏症を調査するために使用されます。共有結合薬剤 - タンパク質複合体とその物理化学的特性評価の効率的な製造方法について説明する。

薬物過敏症におけるIgEが介在する機序の解明のための好塩基球の活性化試験

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

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33.3K ビュー.  University of Salzburg. 好塩基球の活性化の試験は、IgE依存性のアレルギーを検出するための強力なツールです。 in vitroで。ここでは、好塩基球の活性化のテスト用に最適化されたプロトコルは、薬物過敏症を調査するために使用されます。共有結合薬剤 - タンパク質複合体とその物理化学的特性評価の効率的な製造方法について説明する。

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

免疫・感染学

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

抗原特異的規制用のトランス生体内遅延型過敏アッセイ

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

生物発光イメージングを使用した多剤耐性アシネトバクターバウマニバーン感染症のための抗菌ブルーライトセラピーのインビボでの調査に

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.