このプロトコルは、腹側間脳における神経毒6-ヒドロキシドーパミンの脳室内注射後のゼブラフィッシュ運動障害およびその後の回復を実証する上で重要である。この技術は、非常に簡単なセットアップを使用して、6-OHDA病変成体ゼブラフィッシュの腹側間脳におけるドーパミン作動性ニューロンの特異的アブレーションに対応する機能的効果の変化を実証する。神経再生の根底にあるメカニズム、ならびにこのプロセスを調節する内因性および外因性因子に関する将来の研究は、パーキンソン病に対する細胞置換治療戦略に重要な洞察を提供する可能性がある。
魚を通気蒸留ミネラル水タンクに1リットルあたり1グラムの市販の海塩を入れ、28の制御温度、プラスまたはマイナス1°Cで維持します。45リットルのタンクあたり最大25匹の魚を収容し、14時間の光と10時間の暗い光周期にさらします。フリーズドライワームを補充した食物ペレットを少なくとも1日2回魚に給餌する。
250ミリリットルの蒸留水に2.5グラムのトリカインメタンスルホン酸塩と5グラムの炭酸水素ナトリウムを溶解して、トリカインメタンスルホン酸塩の原液を調製する。2ミリリットルの原液を希釈して、200ミリリットルの作業麻酔溶液を作る。99.96ミリモルの6-ヒドロキシドーパミンを新たに調製し、まず0.2ミリグラムのアスコルビン酸を体積0.9%重量の滅菌濾過塩化ナトリウム1ミリリットルに溶解した。
0.2ミクロンのフィルターで溶液をろ過する。次いで、粉末形態の25ミリグラムの6-ヒドロキシドーパミンを溶液に加える。麻酔をかけた魚を水に浸したスポンジの上に置き、実体顕微鏡の下に置き、魚を定期的に濡らします。
メトピー縫合糸、冠状縫合糸および矢状縫合糸の交点に基づいて、ゼブラフィッシュ脳の頭頂部および前頭蓋骨をつなぐ注射位置を特定する。次に、鋭い27ゲージの針を使用して、1ミリメートル四方の小さな穴を開けます。マイクロキャピラリーインジェクターを60度の角度で下げ、ゼブラフィッシュの頭蓋骨の頭蓋屋根から1200マイクロメートルの深さに達するまで下げます。
Zリミットを押して位置を固定します。初期射出圧力を 4, 000 ヘクトパスカルに設定します。2.3秒での注射持続時間。
補償圧力は10ヘクトパスカルまで。その後の各注射で、注射の強度を下げます。偽対照群に0.5マイクロリットルの99.96ミリモル神経毒6-ヒドロキシドーパミンまたは0.9体積%重量の生理食塩水を注入し、微小毛細血管を20秒間休ませる。
乾燥を防ぐために、プロセス全体を通して蒸留水で魚を濡らし続けます。ゆっくりとマイクロキャピラリーを取り除き、実行中の蒸留水の下で魚を蘇生させます。魚を隔離された回収タンクに入れ、回復プロセスを妨害する可能性のある気を散らすものを取り除きます。
次の注射の前にマイクロキャピラリーを洗い流し、閉塞を解消し、注射の強度が0.5マイクロリットルの6-ヒドロキシドーパミンの所望の体積を得るのに十分であることを確認する。ゼブラフィッシュの自発運動評価を個々に行い、オープンタンク試験を介して、3日目および30日目に、6−ヒドロキシドーパミンを投与する。壁が白い紙で覆われた実験用タンクを、盛り上がったプラットフォームに置きます。
光源を使用して、タンクを下から照らします。タンクに80〜90%の蒸留水を満たし、温度を摂氏28度、プラスまたはマイナス1度に維持します。温度計を使用して温度を測定し、市販の水槽ヒーターを使用して温度を調整します。
最低2分間の順応後、ビデオカメラを用いて、実験領域の2次元平面上の計画的なビューから魚の遊泳行動を記録する。不整合を避けるために、記録の異なるバッチでは、順応の10分を超えないようにしてください。オープンタンクプロトコルを備えたビデオトラッキングソフトウェアを使用してビデオを分析し、各被験者の移動距離と平均速度を取得します。
本実験は、6−ヒドロキシドーパミンによる脳室内マイクロインジェクション後の成体ゼブラフィッシュの遊泳行動の変化を評価した。関心のある主な脳領域は腹側間脳であり、視神経前領域、結核後部および視床下部からなる。腹側間脳におけるチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ドーパミン作動性ニューロンの85%以上が、病変後3日目にアブレーションされた。
チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ドーパミン生成ニューロンの数は、その後、病変後30日目に完全な再生を達成する前に、病変後14日目に50%以上増加する。ビデオ追跡ソフトウェアを用いたゼブラフィッシュの遊泳行動の分析は、病変後3日目の病変群の平均速度および移動距離の両方が、偽物と比較して45%未満に有意に減少したことを示した。病変群は、偽物と比較した場合、病変後30日目に運動機能の回復を示し、平均速度または移動距離のいずれにも有意差はなかった。
自発運動評価を一定の時間枠内に実施することが重要です。たとえば、午前 8:00 から午後 12:00 などです。そして、実験を通して、水温は摂氏28度に維持された。浅瀬や不安様行動のような他の行動テストは、成体ゼブラフィッシュ脳の6-OHDA注射後のドーパミン作動性ニューロンアブレーションのさらなる変化または機能的効果を探索するために実施することができる。
