その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

このプロトコルは、in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを使用し、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。このプロトコルは、さまざまな段階の胚、さまざまな厚さの組織切片、およびさまざまな臓器に適用できます。まず、約10個の胚を0.5〜1ミリリットルの新鮮な4%パラホルムアルデヒドで1.5ミリリットルのマイクロファージチューブに摂氏4度で一晩12〜14時間固定します。

PBST中の25、50、および75%メタノールで室温でそれぞれ5分間連続して洗浄することにより、胚を徐々に脱水します。次に、胚を100%メタノール中で室温で5分間洗浄する。胚を100%メタノール中でマイナス20°Cで少なくとも一晩、12〜14時間インキュベートします。

PBST中の75、50、および25%メタノールで室温でそれぞれ5分間連続して洗浄することにより、胚を徐々に再水和します。再度、胚をPBSTで室温でそれぞれ5分間3回洗浄する。室温でPBST中でプロテイナーゼK1ミリリットル当たり10マイクログラムで胚を消化し、PBSTで5分間胚を3回洗浄する。

次に、洗浄した胚を4%パラホルムアルデヒドに室温で15分間再固定します。再度、胚をPBSTで3回洗浄し、各洗浄中に5分間インキュベートします。胚をプレハイブリダイズするには、それらをプレハイブリダイゼーション溶液中で摂氏65度で5分間インキュベートします。

次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をハイブリダイゼーション溶液と交換し、少なくとも4時間プレハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション溶液中のプローブを摂氏95度で5分間加熱してから、胚に加えます。胚を空気と接触させないように、できるだけ多くのプレハイブリダイゼーション溶液を除去する。

胚を含むチューブに、予熱したプローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、プローブを摂氏50〜70度で12〜14時間一晩ハイブリダイズさせます。翌日、プローブ溶液をピペットで吸引し、マイナス20°Cのチューブに保管して、何度も再利用できるようにします。胚を100%ハイブリダイゼーション溶液で洗浄した後、摂氏65度で15分間、SSCTの2倍の濃度の75、50、および25%ハイブリダイゼーション溶液で順次洗浄します。

その後、胚をSSCTの濃度の2倍と0.2倍で摂氏65度で15分間洗浄します。胚を室温のMABT中で10分間2回洗浄する。ハイブリダイズおよび洗浄した胚を室温で少なくとも2時間、2%ブロッキング溶液-1でブロックします。

ブロッキング溶液-1を新しい2%ブロッキング溶液-1中のアンチジゴキシゲニンアルカリホスファターゼと交換し、摂氏4度で12〜14時間一晩振とうします。その後、胚をMABT中で室温で30分間4回洗浄する。繰り返しますが、胚をNTMTで2回洗浄し、ピペットを使用して胚からできるだけ多くのNTMTを取り除きます。

BMパープルアルカリホスファターゼ基質と交換し、暗所で室温で胚を染色します。汚れができたら、NTMTで2回短時間すすぎ、反応を止めます。in situハイブリダイゼーション後、胚をPBSTで20分間3回すすぐ。

胚をPBSの5%スクロースに4°Cで12〜14時間一晩浸します。次に、胚を覆う溶液をPBS中の15%スクロースに変更し、摂氏4度で12〜16時間一晩インキュベートします。繰り返しになりますが、胚を覆う溶液をPBS中の30%スクロースに変更し、摂氏4度で1〜2日間インキュベートします。

胚を組織用の新しいクライオモールドに移し、気泡の形成を避けながら、最適な切断温度の培地で静かに満たします。次に、クライオスタットを使用して標本を12〜20マイクロメートルの厚さの切片に切断し、切片をスライドガラスにすばやく移します。サンプルを室温に到達させ、その後の使用のために摂氏マイナス80度の密閉スライドボックスにセクションを保管します。

切片を含むスライドをPBSで5分間洗浄します。次に、スライドをバッファーに入れ、溶液を約20分間加熱して沸騰温度に近づけます。余分な溶液を排出し、各セクションの周囲をティッシュで慎重に乾燥させます。

次に、撥水性ペンで切片の周りに円を描いて疎水性バリアを形成し、室温でブロッキング溶液-2で2時間切片をブロックします。一次抗体溶液をスライドごとにピペットで送り、免疫組織化学的ウェットボックス内で4°Cで一晩インキュベートします。各洗浄中に10分間インキュベートしながらスライドをPBSで3回洗浄し、余分なPBSを排出します。

次に、スライドを適切な二次抗体とともにPBS中で室温で1時間インキュベートします。再度、各洗浄中に10分間インキュベートしながらスライドをPBSで3回洗浄し、余分なPBSを排出します。続いて、封入剤をスライド上にピペットで移し、スライドカバースリップで取り付けます。

中枢神経系における5-HT2C受容体の発現は、トランスジェニックfoxP2 egfp-caax系統において検出された。5-HT2Cの同時発現は、フルオレセイン緑色蛍光タンパク質によって標識されたfoxP2ニューロンと共にトランスジェニック株において観察された。ゼブラフィッシュの脊髄および運動ニューロンにおけるジンクフィンガー転写因子であるinsm1aの発現がトランスジェニック系統で検出されました。

insm1aの同時発現は、フルオレセイン緑色蛍光タンパク質によって標識されたhb9ニューロンと一緒にトランスジェニックラインで観察されました。ゼブラフィッシュは作りたてのパラホルムアルデヒドで固定する必要があります。