生体外培養は、造血幹および前駆細胞の再増殖の可能性を妨げる可能性があります。私たちのプロトコルは、培養中に幹細胞性を維持し、したがって、in vivoでの遺伝子改変細胞の頻度を改善します。造血幹細胞遺伝子治療は現在、単一遺伝子疾患やHIVなどの感染症に採用されています。
HSPC遺伝子治療プロトコルは、生体外培養に大きく依存しています。私たちのプロトコルは、ex vivo培養を使用するあらゆる手順と互換性がある必要があります。このプロトコルを実証するのは、私の研究室の博士課程の学生であるVigneshwaran Venkatesanです。
HSPCを単離した後、サイトカインおよび低分子レスベラトロール、UM729、およびStemRegenin1を含む幹細胞培養培地で培養します。遺伝子編集の前に、サーモミキサーを摂氏 37 度に設定してガイド RNA を再構成し、TE バッファーを摂氏 37 度で 10 分間予熱します。合成化学修飾sgRNAバイアルを摂氏4度で1分間11, 000倍gで遠心分離し、1.5ナノモルの凍結乾燥sgRNAを含むバイアルに15マイクロリットルのTEバッファーを加え、穏やかな旋回で混合して、マイクロリットルあたり100ピコモルの最終濃度を得ます。
バイアルをサーモミキサーで、摂氏37度で30〜40秒間最小限の振とうでインキュベートします。バイアルの側面を軽くたたき、バイアルを回転させて15マイクロリットルのsgRNAを収集します。1マイクロリットルのアリコートを作り、摂氏マイナス80度で最長1年間保管します。
ヌクレオフェクションの場合は、室温で200倍gで5分間遠心分離することにより10個目の細胞を2回〜5個目にペレット化する。上清が廃棄されたら、ペレットを20マイクロリットルのバッファーに再懸濁します。気泡を避けて、細胞懸濁液を調製したRNP複合体と穏やかに混合する。
次に、懸濁液を市販のヌクレオフェクションストリップに移し、パルスコードDZ-100を選択して4D-Nucleofectorを使用して細胞をエレクトロポレーションします。ニュークレオフェクションストリップ内のエレクトロポレーションされた細胞に、100マイクロリットルのプレインキュベート培養培地を加え、細胞を室温で10分間乱さないままにします。インキュベーションの最後に、実験要件に従って内容物を培養プレートに移します。
HSPC移植の6〜8時間前にNSGマウスをパイケージに入れます。市販の照射器を用いて3.5グレイのマウスに照射する。NBSGWの場合、HSPC移植の48時間前に体重1キログラムあたり12.5ミリグラムの用量でブスルファンを腹腔内注射することにより、6〜8週齢の雄および雌マウスを予め条件付けた。
1匹のマウスを注入する場合は、200倍gで5分間遠心分離することにより1.5ミリリットルのチューブに10〜5番目の細胞を6回ペレット化する。室温で。ペレットを乱すことなく上清を静かにピペットで取り出し、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
予め調整したNSGまたはNBSGWマウスをマウス拘束装置に入れ、尾静脈注射によってHSPCを注入します。マウスの尾を持ち、プラグをそっと押してマウスを拘束します。マウスの尾を70%エタノールでそっと拭きます。
31ゲージのインスリンシリンジを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を吸引する。次に、赤外線ランプからの光を30〜40秒間尾に向け、マウスの体の領域をティッシュペーパーのひだで覆います。シリンジで尾をプレーナー軸に維持するには、左人差し指で持ち上げます。
針の斜角部分を左右の尾尾静脈に20度の角度でそっと挿入します。プランジャーを押して細胞懸濁液を静脈に注入し、ティッシュペーパーで穴を開けた領域の近くに穏やかな圧力をかけ、針を引き抜きます。麻酔後、動物を腹側横臥状態に置き、マウスをそっとこすって目を開き、目の球がわずかに突き出るようにします。
牧草ピペットを30〜45度の角度で、ニクテーティング膜の下の目の内側眼窩にそっと挿入します。パスツールピペットを適切な位置に置いた後、チューブにわずかな圧力を加え、チューブを穏やかに回転させ始めます。50〜80マイクロリットルの末梢血を採取した後、眼の内側眼窩からピペットを静かに引き出します。
安楽死後、尿道の1センチメートル上に垂直切開を行い、横隔膜から1センチメートル下まで伸ばします。切開部の角を水平に切り、腹部を開きます。大腿骨と脛骨を解剖した後、ハサミを使用して大腿骨と脛骨に付着した軟組織を取り除き、ティッシュペーパーで骨をそっとこすります。
メスを使用して、0.5ミリリットルの微量遠心チューブの底に直径0.2センチメートル以下の小さな穴を開けます。メスで骨の近位端を取り除き、切断面を0.5ミリリットルの微小遠心チューブの穴に向けて骨を置きます。次に、100マイクロリットルの滅菌PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに骨を入れた0.5ミリリットルのチューブを置きます。
蓋を閉め、室温で無菌条件下で200倍gで3分間チューブを回転させ、骨髄腔が空の骨を含む0.5ミリリットルのチューブを廃棄する。骨髄を含む1.5ミリリットルの反応管に、1ミリリットルのPBSを加え、次に1ミリリットルのピペットを使用して、細胞を10回静かに再懸濁します。1ミリリットルの細胞懸濁液を、9ミリリットルのRBC溶解バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移します。
2分ごとにチューブを静かに反転させて、細胞を氷中で7分間インキュベートします。インキュベート後、チューブを室温で200倍gで5分間遠心分離し、透明な淡い白色ペレットが観察されるまで洗浄を繰り返します。生細胞およびCD34陽性、CD90陽性細胞の頻度は、核放出の48時間後にRUS群において増加した。
72時間後、DMSO治療群と比較して、RUS治療群でインデルの割合と頻度が増加し、遺伝子編集の増加が示唆されました。CD34陽性、CD90陽性細胞、および総有核細胞の絶対数は、編集後48時間で有意に高くなっています。NSGマウスのヒトCD45陽性細胞のフローサイトメトリー分析では、培養条件での生着の増加が示されました。
マウスBM細胞における遺伝子編集頻度の分析は、RUS添加培養条件における遺伝子編集HSPCの生着の増加を示した。HSPCを1mLあたり200, 000細胞の合流点で培養することは、機能的な幹細胞を改善するために重要です。臍帯血幹細胞とiSPC由来幹細胞の増幅は、このプロトコルがテストされている新しい領域です。
