この方法は、インフルエンザウイルス感染細胞のタンパク質がカスパーゼによる分解または切断を受けるかどうかを決定および確認し、カスパーゼ切断部位を特定するのに役立ちます。この方法は、基本的な分子細胞生物学の実験室の設定と研究スキルのみを必要とし、特別な機器やソフトウェアのトレーニングを必要としません。この方法は、他の動物のウイルスや微生物による感染、毒素や化学物質などの外部刺激への曝露を含む同様の目的を達成するために適応させることができます。
まず、MDCKまたはA549細胞を12ウェル細胞培養プレートに播種します。細胞を5%二酸化炭素雰囲気下で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細胞から古い培養液を取り出し、各ウェルの細胞を1ミリリットルの無血清MEMで2回洗浄します。
次いで、400マイクロリットルのインフルエンザAウイルス接種材料を添加して細胞を感染させ、1時間培養用のプレートを置いた。インキュベーション後、ウイルスの接種材料を取り除き、MEMで細胞を洗浄します。1ミリリットルの無血清MEMを各ウェルに加え、前のステップで示したように細胞をインキュベートします。
24時間後、1ミリリットルのシリンジプランジャーでそれらをこすることによって細胞を収穫し、それらを1.5ミリリットルのチューブに移す。チューブを 12 、 000G で室温で 2 分間遠心分離し、上清を収集します。細胞ペレットを250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水と遠心分離機で洗浄します。
上清を除去し、100マイクロリットルの細胞溶解バッファーを加える。渦で混ぜる。チューブを摂氏98度で10分間加熱して、細胞を完全に溶解します。
次に、標準的なSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、感染していないサンプルと感染したサンプルから等量のタンパク質を分離します。電気泳動後、タンパク質ゲルをニトロセルロースまたはPVDFメンブレンに移し、ウェスタンブロッティングを行います。模擬処理された感染サンプルレーンと阻害剤処理された感染サンプルレーンのタンパク質レベルを比較します。
Opti-MEMなどの100マイクロリットルの適切な培地で、100ナノモルのコントロールまたはカスパーゼsiRNA、または適切な量のトランスフェクション試薬を希釈します。室温で5分間インキュベートします。各siRNA溶液100マイクロリットルをトランスフェクション試薬溶液100マイクロリットルと混合し、室温で20〜45分間インキュベートします。
800マイクロリットルの完全増殖培地に100, 000個のMDCKまたはA549細胞を分割して加えます。200マイクロリットルのsiRNAトランスフェクション試薬複合体を添加し、この懸濁液を12ウェル培養プレートに加えます。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気下で72時間インキュベートします。
細胞にインフルエンザAウイルスを感染させるが、阻害剤は感染しない。ウェスタンブロッティングを行い、前に示したようにタンパク質レベルを比較します。ポリペプチド上のカスパーゼ切断モチーフXXXDおよびDXXDを見つけます。
P1をアスパラギン酸、2つのグルタミン酸、またはアラニンに部位特異的変異誘発法により変異させ、DNAシーケンシングにより確認する。100マイクロリットルの適切な培地で、2マイクログラムの野生型または変異型の血漿DNA、または推奨量のトランスフェクション試薬を希釈し、室温で5分間チューブをインキュベートします。100マイクロリットルの血漿DNA溶液と100マイクロリットルのトランスフェクション試薬溶液を混合し、室温で20〜45分間インキュベートします。
それまでの間、300, 000個のMDCKまたはA549細胞を800マイクロリットルの完全増殖培地に分割して追加します。200マイクロリットルのDNAトランスフェクション試薬複合体を添加し、この懸濁液を12ウェル培養プレートに加えます。プレートを5%二酸化炭素雰囲気下で摂氏37度でインキュベートします。
48時間後、阻害剤なしで細胞にインフルエンザAウイルスを感染させます。ウェスタンブロッティングを行い、前に示したようにタンパク質レベルを比較します。ウエスタンブロッティングを用いて、インフルエンザ誘発宿主カスパーゼによる宿主コルタクチンの分解を評価した。
インフルエンザウイルス感染細胞をカスパーゼ-3阻害剤で処理すると、コルタクチンとウイルスNP分解が救出されました。コルタクチンバンドの強度の定量化および対応するアクチンバンドによるその正規化は、カスパーゼ-3阻害剤処理感染細胞中のコルタクチンのレベルが未処理感染細胞と比較して高いことを示した。カスパーゼ-6またはカスパーゼ-7では細胞が枯渇した。
コルタクチンポリペプチドレベルの有意な回復は観察されなかったが、カスパーゼ-3枯渇細胞では、コルタクチンはインフルエンザウイルスから回復し、分解を誘導した。ポリペプチドレベルの定量化および比較は、カスパーゼ-3発現が枯渇した感染細胞におけるコルタクチンポリペプチドレベルが、正常なカスパーゼ-3発現を有する細胞よりも高いことを示した。116位のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異により、コルタクチンポリペプチドはインフルエンザウイルス誘発分解に対して耐性になりました。
ポリペプチドレベルの定量化および比較は、感染細胞における変異型コルタクチンポリペプチドのレベルが野生型コルタクチンポリペプチドのレベルよりも高いことを示した。数十の変異体を生成し、ポリペプチドのカスパーゼ切断部位を特定するために、ウェスタンブロッティングを繰り返し行う必要があります。精製されたカスパーゼと標的ポリペプチドを含むin vitro生化学的アッセイを開発して、目的のタンパク質が直接ガスベースの基質であることを確認することができます。
このプロトコルは、ウイルス感染や疾患など、研究されているシステムにおける標的タンパク質の重要性、分解または切断を理解するのに役立ちます。
