この方法は、in vivoでの前立腺癌細胞の骨転移の自然な進行を厳密に模倣する理想的なモデルを作成するのに役立ちます。この技術は、骨転移の利点を有し、生体内の前立腺癌細胞の自然な骨転移過程を表す。この技術は、前立腺癌の骨転移に対する分子メカニズムの探索とin vivo治療効果の調査に役立ちます。
注射当日は、10cm細胞培養皿で培養した80〜90%コンフルエントなルシフェラーゼ標識PC3細胞を採取し、冷滅菌PBSで2回洗浄して注射用細胞の準備を開始します。洗浄した細胞を1.5ミリリットルの0.25%トリプシンで3分間トリプシン処理した後、10%血清を含む6ミリリットルのF12培地を加えてトリプシンをクエンチし、細胞を15ミリリットルの遠沈管に回収します。回収した細胞懸濁液20マイクロリットルをセルカウントプレートに移し、自動セルカウンターを用いて細胞濃度を算出する。
次に、細胞を室温で800 Gで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄し、細胞ペレットをF12培地に再懸濁して、目的の最終細胞密度を達成します。次に、細胞を手術室に運び、2時間以内に細胞注入を行います。注射まで細胞を氷上に保ちます。
手術を開始するには、麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、両上肢を正中線から垂直に伸ばして固定します。外科用粘着テープを使用して、強く押したり内臓を移動させたりすることなく、マウスを腹部から下に固定します。70%エタノール綿棒を使用して胸部の皮膚を消毒します。
次に、前胸壁の中央を触診して、胸骨中央の下端にあるくぼみにマウス剣状突起を見つけます。剣状突起の最も劣った点にラベルを付けます。次に、前胸壁の中央から触診することにより、マニュブリウムの上部境界にある中央のくぼみにマウス頸静脈ノッチを配置し、頸静脈ノッチの最も下側のポイントをマークします。
次に、前の2つのマークの間の中間点を見つけて、3番目の肋間腔の心臓の少し右に向かってマークします。これが射出ポイントです。細胞懸濁液を十分に混合してから、200マイクロリットルの懸濁液を26ゲージ針で取り付けた1ミリリットルのシリンジに入れます。
プランジャーと懸濁液の間のシリンジに空気を残して、注射中に脈動する血液が入るようにします。注射を行うには、注射部位を通して針を垂直に挿入します。針先が左心室に正しく挿入されると、針ハブに真っ赤な脈動する血液が見えます。
血液の脈動が見えない場合、または血液が凝固している場合は、注射を再試行してください。針が適切に挿入されたら、安定した手で40〜60秒かけて100マイクロリットルの細胞懸濁液を非常にゆっくりと注入します。注入終了後、乾いた綿棒で注射部位に15秒間圧力をかけながら針を引っ込め、止血を確実にします。
マウスを清潔なケージに戻し、麻酔から完全に回復するまで動物を監視します。ルシフェラーゼ標識PC3細胞をマウスに注入してから24時間後に行った生物発光イメージングは、動物の全身からのシグナルを示し、体循環中の癌細胞の存在を示しました。転移性病変は注射の2週間後にマウスの後肢に現れた。
転移性病変は時間が経つにつれて大きくなり、他の部位に現れ始めました。前立腺癌細胞誘発性骨の転移病変は、動物の近位脛骨の骨破壊を示したX線イメージングを使用してさらに検出されました。同じことがマイクロCTスキャンによっても確認されました。
転移病変は、ヘマチンおよびエオジン染色によってパラフィン包埋組織でさらに確認されました。正確な注入部位は、このモデルの成功率を確保するために非常に重要です。これは練習によって達成することができます。
