実験的に進化した集団における構造変異のダイナミクスの追跡

挿入、欠失、重複、反転などの構造変異は、これまで実験的に追跡することがより困難であり、それらの頻度はアンプリコンシーケンシングによって正確に測定することはできませんでした。ここでは、三重プライマー設計と並列キャピラリーエレクトロフェレーシスを組み合わせて、構造バリアント対立遺伝子頻度を経時的に追跡する、シンプルで費用対効果の高い技術を提供します。この方法は、実験的進化におけるエンドポイントシーケンシングを補完し、新興のde novo対立遺伝子の頻度をたどるように設計されました。

この方法が宿主内病原体データを扱う人々にも役立つことを願っています。手順を実演するのは、私たちの研究室の研究助手であるジャンヌ・ハメットです。方法の異なるステップは、誘導された対立遺伝子がmutSと呼ばれる細菌遺伝子へのIS10挿入から生じる場合に示される。

まず、変異体挿入部位の周りの野生型対立遺伝子上の短いアンプリコンを増幅するための一対のプライマーを設計する。挿入配列内にフォワードプライマー2の第3のプライマーを設計し、野生型アンプリコンからわずかなサイズ変数を生成する。まず、固定野生型および変異対立遺伝子クローンの24時間培養物からDNAを抽出します。

DNAを定量した後、各DNA抽出物を水で1マイクロリットルあたり5ナノグラムに希釈します。2つのサンプルを50/50の比率で固定します。10ナノグラムのDNAサンプル、プライマー、PCRマスターミックスを含む20マイクロリットルの反応を設定します。

次に、2%アガロースゲルを用いて電気泳動によりPCR産物を分離する。野生型のアンプリコンと変異体のサイズの違いは、ゲル上で検証する必要があります。検量線を取得するには、野生型DNAと変異型DNAをさまざまな比率で混合することから始めます。

PCR産物をマイクロリットルあたり0.1ナノグラムの濃度に希釈します。分離ゲルを調製するには、新鮮なゲルと染料を混合します。インレットバッファを交換してください。

リンスバッファーを平行キャピラリー電気泳動装置の正しい引き出し位置に置きます。22マイクロリットルの希釈マーカーを96ウェルプレートのウェルに追加します。次に、2マイクロリットルの希釈PCR産物を各サンプルウェルに追加します。

1つのウェルに、サイズが1〜6, 000塩基対の範囲の高感度キットからDNAサイズのはしごを追加します。マイクロプレートをパラレルキャピラリー電気泳動装置に配置し、装置ソフトウェアで選択を実行します。データ分析ソフトウェアを使用して結果を分析します。

まず、既知のサイズに基づいてピークを特定します。各アンプリコンを定量して検量線を作成します。最後に、2つの対立遺伝子の相対量が正しく測定されていることを確認します。

次に、この検量線を使用して、PCR増幅および並列キャピラリー電気泳動後の構造変異の量を計算します。これらの代表的な結果は、mutS遺伝子への破壊的挿入に続く。ノックダウンと変異Sはハイパーミューテーター表現型につながり、細菌が基本突然変異率よりも多くの突然変異をサンプリングできるようにします。

提示された方法を使用して、mutS構造バリアント頻度を1000世代にわたって追跡しました。新興変異対立遺伝子の非単調な軌跡が明らかになった。変異対立遺伝子は、第680世代で最初に検出されました。

その後、対立遺伝子の頻度は急速に増加し、ジェネレーション713までに67%に達しました。その後、この増加は停滞し、次の53世代でわずか10%増加し、76%に予想外に、変異対立遺伝子頻度は13世代にわたって76%から49%に減少し、その後固定に増加しました。この方法は、実験的進化に取り組んでいる人々に利益をもたらすでしょう。

このプロトコルにより、ユーザーは凍結されたアーカイブを取得し、エンドポイントシーケンスデータでは観察できない進化の軌跡を探索できます。