Структурные варианты, такие как вставки, делеции, дублирования и инверсии, в прошлом было труднее отслеживать экспериментально, и их частоты не могут быть точно измерены с помощью секвенирования ампликонов. Здесь мы предлагаем простой экономически эффективный метод, который объединяет тройной дизайн праймера и параллельный капиллярный электроферез для отслеживания частот аллелей структурных вариантов с течением времени. Этот метод был разработан, чтобы дополнить секвенирование конечных точек в экспериментальной эволюции и проследить частоты возникающих аллелей de novo.
Мы надеемся, что этот метод также принесет пользу тем, кто работает с данными о патогенах внутри хозяев. Демонстрировать процедуру будет Жанна Хамет, научный сотрудник нашей лаборатории. Различные этапы методов будут показаны в случае, когда производный аллель является результатом вставки IS10 в бактериальный ген, называемый mutS.
Во-первых, разработайте пару праймеров для амплификации короткого ампликона на аллеле дикого типа вокруг места вставки мутантов. Разработайте третий праймер вперед праймер два в последовательности вставки, чтобы получить небольшую переменную размера из ампликона дикого типа. Начните с извлечения ДНК из 24-часовых культур фиксированного дикого типа и мутантных аллельных клонов.
После количественного определения ДНК разбавьте каждый экстракт ДНК до пяти нанограммов на микролитр водой. Зафиксируйте два образца в соотношении 50/50. Настройте реакцию объемом 20 микролитров, содержащую 10 нанограммов образца ДНК, праймеров и мастер-смеси для ПЦР.
Затем отделяют продукт ПЦР с помощью электрофореза, используя 2%-ный агарозный гель. Разница в размерах между ампликонами дикого типа и мутанта должна быть проверена на геле. Чтобы получить калибровочную кривую, начните со смешивания ДНК дикого типа и мутантной ДНК в различных соотношениях.
Разбавьте продукты ПЦР до 0,1 нанограмма на микролитр концентрации. Чтобы приготовить разделительный гель, смешайте свежий гель и краситель. Замените входной буфер.
Поместите буфер для полоскания в правильное место ящика прибора для параллельного капиллярного электрофореза. Добавьте 22 микролитра маркера разбавителя в лунки 96-луночной пластины. Теперь добавьте два микролитра разбавленных продуктов ПЦР в каждую лунку образца.
К одному Ну, добавьте лестницу размера ДНК из высокочувствительного набора, размером от одной до 6 000 пар оснований. Поместите микропланшет в прибор для параллельного капиллярного электрофореза в выбранном прогоне программного обеспечения прибора. Проанализируйте результаты с помощью программного обеспечения для анализа данных.
Во-первых, определите пики на основе их известного размера. Количественно оцените каждый ампликон, чтобы получить калибровочную кривую. Наконец, убедитесь, что относительные количества двух аллелей измерены правильно.
Эта калибровочная кривая затем используется для расчета количества структурных вариантов после амплификации ПЦР и параллельного капиллярного электрофореза. Эти репрезентативные результаты следуют за разрушительной вставкой в ген mutS. Нокдауны и mutS приводят к фенотипу гипермутатора, позволяя бактериям отбирать больше мутаций, чем их базовая частота мутаций.
С помощью представленного метода отслеживалась частота структурных вариантов mutS на протяжении 1000 поколений. Выявлена немонотонная траектория формирующегося мутантного аллеля. Мутантный аллель был впервые обнаружен в поколении 680.
Затем аллель быстро увеличился в частоте, достигнув 67% к поколению 713. Затем это увеличение застопорилось, увеличившись всего на 10% в течение следующих 53 поколений, до 76%Неожиданно частота мутантных аллелей затем снизилась с 76% до 49% в течение 13 поколений, после чего она увеличилась до фиксации. Этот метод принесет пользу тем, кто работает над экспериментальной эволюцией.
Этот протокол позволяет пользователю брать замороженные архивы и исследовать эволюционные траектории, которые в противном случае невозможно наблюдать с помощью данных секвенирования конечных точек.
