Las variantes estructurales como inserciones, deleciones, duplicaciones e inversiones han sido en el pasado más difíciles de seguir experimentalmente, y sus frecuencias no pueden medirse con precisión mediante la secuenciación de amplicones. Aquí proporcionamos una técnica simple y rentable, que combina triplicar el diseño del cebador y la electroféresis capilar paralela para seguir las frecuencias alélicas de variantes estructurales a lo largo del tiempo. Este método fue diseñado para complementar la secuenciación de puntos finales en la evolución experimental y para rastrear las frecuencias de alelos emergentes de novo.
Esperamos que este método también beneficie a aquellos que trabajan con datos de patógenos intra huéspedes. Demostrando el procedimiento estará Jeanne Hamet, una asistente de investigación de nuestro laboratorio. Los diferentes pasos de los métodos se mostrarán en un caso en el que el alelo derivado resulta de una inserción IS10 en un gen bacteriano llamado mutS.
Primero diseñe un par de cebadores para amplificar un amplicón corto en el alelo de tipo salvaje alrededor del sitio de inserción mutante. Diseñe un tercer cebador hacia adelante dos dentro de la secuencia de inserción para producir una ligera variable de tamaño del amplicón de tipo salvaje. Comience extrayendo ADN de cultivos de 24 horas de tipo salvaje fijo y clones de alelos mutantes.
Después de cuantificar el ADN, diluya cada extracto de ADN a cinco nanogramos por microlitro con agua. Fije las dos muestras en una proporción de 50/50. Configure una reacción de 20 microlitros que contenga 10 nanogramos de muestra de ADN, cebadores y mezcla maestra de PCR.
A continuación, separe el producto de PCR por electroforesis, utilizando un gel de agarosa al 2%. La diferencia de tamaño entre los amplicones del tipo salvaje y el mutante debe verificarse en el gel. Para obtener una curva de calibración, comience mezclando el ADN de tipo salvaje y el ADN mutante en varias proporciones.
Diluir los productos de PCR a 0,1 nanogramos por concentración de microlitro. Para preparar el gel de separación, mezcle el gel fresco y el tinte. Reemplace el búfer de entrada.
Coloque el tampón de enjuague en la ubicación correcta del cajón del instrumento de electroforesis capilar paralela. Agregue 22 microlitros del marcador diluyente a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Ahora agregue dos microlitros de los productos de PCR diluidos a cada pocillo de muestra.
A un pozo, agregue una escalera de tamaño de ADN de un kit de alta sensibilidad, que va de uno a 6, 000 pares de bases de tamaño. Coloque la microplaca en el instrumento de electroforesis capilar paralela en una ejecución seleccionada en el software del instrumento. Analice los resultados utilizando el software de análisis de datos.
Primero, identifique los picos en función de su tamaño conocido. Cuantifique cada amplicón para producir una curva de calibración. Finalmente, verifique que las cantidades relativas de los dos alelos se midan correctamente.
Esta curva de calibración se utiliza para calcular la cantidad de variantes estructurales después de la amplificación por PCR y la electroforesis capilar paralela. Estos resultados representativos siguen una inserción disruptiva en el gen mutS. Los knockdowns y mutS conducen a un fenotipo hipermutador, lo que permite a las bacterias muestrear más mutaciones que su tasa de mutación base.
Utilizando el método presentado, se rastreó la frecuencia de la variante estructural mutS a través de 1000 generaciones. Se reveló una trayectoria no monótona del alelo mutante emergente. El alelo mutante se detectó por primera vez en la generación 680.
El alelo aumentó rápidamente en frecuencia, alcanzando el 67% en la generación 713. Este aumento luego se estancó, aumentando solo un 10% en las siguientes 53 generaciones, a 76% Inesperadamente, la frecuencia de alelos mutantes disminuyó del 76% al 49% en el transcurso de 13 generaciones, después de lo cual aumentó a la fijación. Este método beneficiará a aquellos que trabajan en la evolución experimental.
Este protocolo permite al usuario tomar archivos congelados y explorar trayectorias evolutivas que de otro modo no serían observables con los datos de secuenciación de puntos finales.
