Strukturelle Varianten wie Insertionen, Deletionen, Duplikationen und Inversionen waren in der Vergangenheit experimentell schwieriger zu verfolgen, und ihre Frequenzen können durch Amplikonsequenzierung nicht genau gemessen werden. Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige Technik zur Verfügung, die das dreifache Primerdesign und die parallele Kapillarelektropherese koppelt, um strukturelle variante Allelfrequenzen im Laufe der Zeit zu verfolgen. Diese Methode wurde entwickelt, um die Endpunktsequenzierung in der experimentellen Evolution zu ergänzen und die Häufigkeiten neu auftretender De-novo-Allele zu verfolgen.
Wir hoffen, dass diese Methode auch denjenigen zugute kommt, die mit Intra-Host-Pathogendaten arbeiten. Das Verfahren wird von Jeanne Hamet, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, demonstriert. Die verschiedenen Schritte der Methoden werden in einem Fall gezeigt, in dem das abgeleitete Allel aus einer IS10-Insertion in ein bakterielles Gen namens mutS resultiert.
Entwerfen Sie zunächst ein Paar Primer, um ein kurzes Amplikon auf dem Wildtyp-Allel um die mutierte Insertionsstelle herum zu amplifizieren. Entwerfen Sie einen dritten Primer vorwärts Primer zwei innerhalb der Insertionssequenz, um eine leichte Größenvariable aus dem Wildtyp-Amplikon zu erzeugen. Beginnen Sie mit der Extraktion von DNA aus 24-Stunden-Kulturen von fixierten Wildtyp- und mutierten Allelklonen.
Nach der Quantifizierung der DNA verdünnen Sie jeden DNA-Extrakt mit Wasser auf fünf Nanogramm pro Mikroliter. Fixieren Sie die beiden Proben im Verhältnis 50/50. Richten Sie eine 20-Mikroliter-Reaktion ein, die 10 Nanogramm DNA-Probe, Primer und PCR-Mastermix enthält.
Als nächstes trennen Sie das PCR-Produkt durch Elektrophorese unter Verwendung eines 2%igen Agarosegels. Der Größenunterschied zwischen den Amplikons des Wildtyps und der Mutante muss auf dem Gel nachgewiesen werden. Um eine Kalibrierungskurve zu erhalten, mischen Sie zunächst die Wildtyp-DNA und die mutierte DNA in verschiedenen Verhältnissen.
Verdünnen Sie die PCR-Produkte auf eine Konzentration von 0,1 Nanogramm pro Mikroliter. Um das Trenngel herzustellen, mischen Sie das frische Gel und den Farbstoff. Ersetzen Sie den Einlasspuffer.
Platzieren Sie den Spülpuffer an der richtigen Schubladenposition des Instruments mit paralleler Kapillarelektrophorese. Geben Sie 22 Mikroliter des Verdünnungsmarkers in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie nun zwei Mikroliter der verdünnten PCR-Produkte in jede Probenvertiefung.
Fügen Sie zu einem Nun, fügen Sie eine DNA-Größenleiter aus einem hochempfindlichen Kit hinzu, das von einem bis 6.000 Basenpaaren groß ist. Platzieren Sie die Mikrotiterplatte im Auswahllauf der Gerätesoftware in das Instrument für die parallele Kapillarelektrophorese. Analysieren Sie die Ergebnisse mit der Datenanalysesoftware.
Identifizieren Sie zunächst die Peaks anhand ihrer bekannten Größe. Quantifizieren Sie jedes Amplikon, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen. Überprüfen Sie schließlich, ob die relativen Mengen der beiden Allele korrekt gemessen werden.
Diese Kalibrierkurve wird dann verwendet, um die Anzahl der Strukturvarianten nach PCR-Amplifikation und paralleler Kapillarelektrophorese zu berechnen. Diese repräsentativen Ergebnisse folgen einer störenden Insertion in das mutS-Gen. Knockdowns und MutS führen zu einem Hypermutator-Phänotyp, der es Bakterien ermöglicht, mehr Mutationen zu untersuchen als ihre Basismutationsrate.
Mit der vorgestellten Methode wurde die strukturelle Variantenfrequenz von mutS über 1000 Generationen verfolgt. Es wurde eine nicht-monotone Flugbahn des entstehenden mutierten Allels aufgedeckt. Das mutierte Allel wurde erstmals in Generation 680 nachgewiesen.
Die Häufigkeit des Allels nahm dann rasch zu und erreichte bei Generation 713 67 %. Dieser Anstieg stagnierte dann und stieg in den nächsten 53 Generationen nur um 10 % auf 76 % Unerwarteterweise sank die Häufigkeit des mutierten Allels im Laufe von 13 Generationen von 76 % auf 49 %, woraufhin sie zur Fixierung anstieg. Diese Methode wird denjenigen zugute kommen, die an der experimentellen Evolution arbeiten.
Dieses Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, eingefrorene Archive zu entnehmen und evolutionäre Trajektorien zu untersuchen, die sonst mit Endpunktsequenzierungsdaten nicht beobachtbar sind.
