실험적으로 진화한 개체군에서 구조적 변이의 역학을 따릅니다.

삽입, 결실, 복제 및 반전과 같은 구조적 변형은 과거에는 실험적으로 추적하기가 더 어려웠으며 앰플리콘 시퀀싱으로 빈도를 정확하게 측정할 수 없었습니다. 여기서 우리는 시간이 지남에 따라 구조적 변이 대립 유전자 빈도를 따르기 위해 삼중 프라이머 설계와 병렬 모세관 전기 반출을 결합하는 간단한 비용 효율적인 기술을 제공합니다. 이 방법은 실험적 진화에서 종점 시퀀싱을 보완하고 새로운 대립 유전자의 빈도를 추적하도록 설계되었습니다.

우리는 이 방법이 숙주 내 병원체 데이터로 작업하는 사람들에게도 도움이 되기를 바랍니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 연구 조교 인 Jeanne Hamet이 될 것입니다. 방법의 다른 단계는 파생된 대립유전자가 mutS라고 하는 박테리아 유전자에 IS10 삽입으로 인한 경우에 표시됩니다.

먼저 돌연변이 삽입 부위 주변의 야생형 대립유전자에서 짧은 앰플리콘을 증폭하기 위해 한 쌍의 프라이머를 설계합니다. 삽입서열 내에 2개의 정방향 프라이머 3개를 설계하여 야생형 앰플리콘으로부터 약간의 크기 변수를 생성한다. 고정된 야생형 및 돌연변이 대립유전자 클론의 24시간 배양에서 DNA를 추출하는 것으로 시작합니다.

DNA를 정량화한 후 각 DNA 추출물을 물로 마이크로리터당 5나노그램으로 희석합니다. 두 샘플을 50/50 비율로 고정합니다. 10나노그램의 DNA 샘플, 프라이머 및 PCR 마스터 믹스를 포함하는 20마이크로리터 반응을 설정합니다.

다음으로, 2%agarose gel을 이용하여 전기영동에 의해 PCR 산물을 분리한다. 야생형의 앰플리콘과 돌연변이 사이의 크기 차이는 겔에서 확인되어야 합니다. 보정 곡선을 얻으려면 먼저 야생형 DNA와 돌연변이 DNA를 다양한 비율로 혼합합니다.

PCR 산물을 마이크로리터당 0.1 나노그램 농도로 희석한다. 분리 젤을 준비하려면 신선한 젤과 염료를 혼합하십시오. 입구 버퍼를 교체합니다.

헹굼 버퍼를 평행 모세관 전기영동 기기의 올바른 서랍 위치에 놓습니다. 22 마이크로리터의 희석제 마커를 96 웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 이제 희석된 PCR 산물 2마이크로리터를 각 샘플 웰에 추가합니다.

하나의 웰에 1에서 6, 000 염기쌍 크기의 고감도 키트에서 DNA 크기 사다리를 추가합니다. 마이크로플레이트를 평행 모세관 전기영동 기기에 기기 소프트웨어에서 선택한 실행으로 놓습니다. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.

먼저, 알려진 크기에 따라 피크를 식별합니다. 각 앰플리콘을 정량화하여 검량선을 생성합니다. 마지막으로 두 대립 유전자의 상대적 양이 올바르게 측정되었는지 확인합니다.

이 보정 곡선은 PCR 증폭 및 병렬 모세관 전기영동 후 구조적 변형의 양을 계산하는 데 사용됩니다. 이러한 대표적인 결과는 mutS 유전자의 파괴적인 삽입을 따릅니다. 녹다운과 mutS는 하이퍼 돌연변이 표현형으로 이어져 박테리아가 기본 돌연변이 비율보다 더 많은 돌연변이를 샘플링할 수 있도록 합니다.

제시된 방법을 사용하여 mutS 구조적 변형 빈도를 1000세대에 걸쳐 추적했습니다. 신흥 돌연변이 대립 유전자의 비 단조 궤적이 밝혀졌습니다. 돌연변이 대립유전자는 680세대에서 처음 발견되었습니다.

그런 다음 대립 유전자의 빈도가 급격히 증가하여 713 세대까지 67 %에 도달했습니다. 이 증가는 정체되어 다음 53 세대 동안 10 % 만 증가하여 76 %예기치 않게 돌연변이 대립 유전자 빈도는 76 세대 동안 49 %에서 13 %로 감소한 후 고정으로 증가했습니다. 이 방법은 실험적 진화를 연구하는 사람들에게 도움이 될 것입니다.

이 프로토콜을 통해 사용자는 고정된 아카이브를 가져와 엔드포인트 시퀀싱 데이터로 관찰할 수 없는 진화 궤적을 탐색할 수 있습니다.