كانت المتغيرات الهيكلية مثل الإدراج والحذف والازدواجية والانعكاسات في الماضي أكثر صعوبة في المتابعة تجريبيا ، ولا يمكن قياس تردداتها بدقة عن طريق تسلسل amplicon. نقدم هنا تقنية بسيطة فعالة من حيث التكلفة ، والتي تجمع بين تصميم التمهيدي الثلاثي والفصادة الكهربائية الشعرية المتوازية لمتابعة ترددات الأليل المتغيرة الهيكلية بمرور الوقت. تم تصميم هذه الطريقة لاستكمال تسلسل نقطة النهاية في التطور التجريبي وتتبع ترددات أليلات دي نوفو الناشئة.
نأمل أن تفيد هذه الطريقة أيضا أولئك الذين يعملون مع بيانات مسببات الأمراض داخل المضيفين. ستوضح العملية جين هاميت ، مساعدة باحثة من مختبرنا. سيتم عرض الخطوات المختلفة للطرق في الحالة التي ينتج فيها الأليل المشتق عن إدخال IS10 في جين بكتيري يسمى mutS.
قم أولا بتصميم زوج من الاشعال لتضخيم أمبليكون قصير على أليل النوع البري حول موقع الإدخال الطافر. صمم برايمر تمهيدي أمامي ثالث اثنين ضمن تسلسل الإدراج لإنتاج متغير حجم طفيف من النوع البري amplicon. ابدأ باستخراج الحمض النووي من مزارع على مدار 24 ساعة من النوع البري الثابت واستنساخ الأليل الطافر.
بعد تحديد كمية الحمض النووي ، قم بتخفيف كل مستخلص DNA إلى خمسة نانوجرام لكل ميكرولتر بالماء. ثبت العينتين بنسبة 50/50. قم بإعداد تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 10 نانوجرام من عينة الحمض النووي والبادئات والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد ذلك ، افصل منتج PCR عن طريق الرحلان الكهربائي ، باستخدام هلام أغاروز 2٪. يجب التحقق من اختلاف الحجم بين amplicons من النوع البري والمتحولة على الجل. للحصول على منحنى معايرة ، ابدأ بخلط الحمض النووي من النوع البري والحمض النووي الطافر بنسب مختلفة.
تمييع منتجات PCR إلى 0.1 نانوغرام لكل ميكرولتر تركيز. لتحضير جل الفصل ، اخلطي الجل الطازج والصبغة. استبدل المخزن المؤقت للمدخل.
ضع المخزن المؤقت للشطف في موقع الدرج الصحيح لأداة الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي. أضف 22 ميكرولترا من علامة المخفف إلى آبار صفيحة بئر 96. أضف الآن ميكرولتر من منتجات PCR المخففة إلى كل عينة جيدا.
إلى بئر واحد ، أضف سلما بحجم الحمض النووي من مجموعة عالية الحساسية ، يتراوح حجمها من واحد إلى 6000 زوج أساسي. ضع الصفيحة الدقيقة في أداة الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي في تشغيل محدد على برنامج الجهاز. تحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل البيانات.
أولا ، حدد القمم بناء على حجمها المعروف. قم بقياس كل amplicon لإنتاج منحنى معايرة. وأخيرا، تحقق من قياس الكميات النسبية للأليلين قياسا صحيحا.
ثم يتم استخدام منحنى المعايرة هذا لحساب كمية المتغيرات الهيكلية بعد تضخيم PCR والرحلان الكهربائي الشعري المتوازي. تتبع هذه النتائج التمثيلية إدخالا مدمرا في جين mutS. تؤدي الضربات القاضية و mutS إلى نمط ظاهري مفرط الطفرات ، مما يسمح للبكتيريا بأخذ عينات من طفرات أكثر من معدل الطفرة الأساسية.
باستخدام الطريقة المقدمة ، تم تتبع تردد المتغير الهيكلي mutS عبر 1000 جيل. تم الكشف عن مسار غير رتيب للأليل الطافر الناشئ. تم اكتشاف الأليل الطافر لأول مرة في الجيل 680.
ثم زاد الأليل بسرعة في التردد ، ليصل إلى 67 ٪ بحلول الجيل 713. ثم ركدت هذه الزيادة ، حيث زادت بنسبة 10٪ فقط على مدى الأجيال ال 53 التالية ، إلى 76٪ بشكل غير متوقع ، انخفض تردد الأليل الطافر من 76٪ إلى 49٪ على مدار 13 جيلا ، وبعد ذلك زاد إلى التثبيت. هذه الطريقة ستفيد أولئك الذين يعملون على التطور التجريبي.
يسمح هذا البروتوكول للمستخدم بأخذ المحفوظات المجمدة واستكشاف المسارات التطورية التي لا يمكن ملاحظتها باستخدام بيانات تسلسل نقطة النهاية.
