このプロトコルは、微生物の突然変異推定を可能にする。これは、生物が自然突然変異の確率にどのように環境コンテキストに影響を与えるかを実証することができます。このプロトコルの主な利点は、安価で効率的です。
突然変異率の多くの推定値は、並行して行うことができる。このプロトコルが測定する突然変異は、抗生物質に対する耐性に従うことができる。したがって、このプロトコルは、世界最大の課題の1つである抗菌性を研究するために使用することができます。
この方法は、細胞生態学的文脈が抗菌性の進化にどのように影響を与えるかについての洞察を提供することができる。このプロトコルは、検査株の単一培養における突然変異率を推定するが、我々は、バイオニュートラル分子を区別するために2つの株の臨床株および共培養にそれを適用した。このプロトコルで使用される最も危険な反応は、抗生物質リフィンピシンとメタノールです。
リファミシンをメタノールに溶解させる場合は、必ず保護手袋とゴーグルを使用してください。この手順を開始するには、大腸菌K12グリセロールストックからの氷の擦り傷と液体リソジニーブロスの3 mLを接種します。LB文化を120rpm、摂氏37度で約7時間振ります。
この後、生理培養液を生理食塩水で2000倍に希釈する。ここに示すように、各チューブに液体デイビスの最小限の媒体の10 mLを追加し、それぞれに異なる濃度のグルコースを含みます。希釈培養液100マイクロリットルを3本の50mLスクリーンキャップ円錐底ポリマーチューブに加えます。
テキストプロトコルのアウトラインとして、独自の50 mLチューブで、それぞれブドウ糖を含む液体デイビス最小培地の5つの異なる溶液の22 mLを調製します。環境に対するイノキュラを調製するために、まず600ナノメートルでの一晩培養物の光学密度を測定する。生理を生理食塩水で希釈し、各環境に2200~110000個の細胞を加えます。
これにより、環境の1mLの接種器が1000〜5000細胞の間に含まれていることを保証します。次に、196 深い井戸プレートの並列カルチャのランダムなレイアウトを作成します。接種した培地の1mLをレイアウトに従ってプレートの各ウェルに移します。
次に、プレートの蓋をテープで固定し、蓋とテープでプレート全体の重量を量ります。プレートを250rpmで、摂氏37度で24時間振ります。この後、インキュベーターに2Lの蒸留水を入れ、実験セット間で蒸発量を安定化させる。
非選択的TA寒天板上の各接種媒体の10マイクロリットルをめっきすることにより、接種サイズを決定する。寒天表面が乾燥するまで、滅菌L字型スプレッダーを使用してください。次に、リフィンピシンを含有する選択的TA寒天を6つのウェルプレートに調製する。
6つのウェルプレートの各ウェルに選択的TA寒天のピペット5 mL。非選択的寒天プレート上のコロニー形成単位をカウントし、サイズのイノキュラを決定します。24時間のインキュベーションの後、深いウェルプレート全体を計量して蒸発量を決定し、アッセイごとに無作為に選ばれた3つの培養物を標識されたマイクロ遠心チューブに10%程度転送する可能性が高い。
残りの81の平行培養物を深層ウェルプレートからリフィンピシンを含む選択的TA寒天にプレートします。次に、選択寒天プレートから蓋を取り除き、無菌状態で覆い隠して寒天の表面上のすべての液体を乾燥させます。マイクロ遠心分離管から培養液を5回10倍希釈工程で希釈し、900マイクロリットルの生理液を100マイクロリットルの培養工程で混合し、ボルテックスすることによりコロニー形成ユニットの数を決定する。
非選択的TA寒天に最終希釈液のプレート40マイクロリットルをプレートし、プレート上に蓋を置く。摂氏37度で一晩インキュベート。6つのウェルプレート上のすべての井戸が培養液から解放されたら、蓋を元に戻します。
その後、蓋を37°Cで44〜48時間インキュベートします。4日目に、非選択的寒天プレート上のコロニー形成単位を数える。5日目に、選択的TA寒天プレート上の抗生物質に耐性があるコロニーの数を数える。
特定のアッセイについて観察された変異体数の並列培養間の分布を記録する。コンピュータ上の適切なソフトウェアを開きます。[仮説検定] タブで、値をデフォルトのままにします。
[参照]をクリックし、観測された変異体の分布を含むテキストファイルを選択します。ファイルをアップロードしたら、テストを実行してクリックします。右側のテスト結果の下で、ワンサンプルML検定で、突然変異数を見つけます。
これは m で、期待される変異イベントの数です。次に、テキストプロトコルのアウトラインとして特定の環境における特定の遺伝子型の突然変異率を推定する。3つの異なるフェノチマーカー、シクロセリン、リフィンピシン、およびナリジキシン酸のMG1655突然変異率をここに示す。
突然変異率は、80 mg/L、125 mg/L、および250 mg/Lのグルコース濃度を有するデイビス最小培地で評価される。1つの場合には、1000mg/Lのグルコース濃度が使用される。予想通り、シクロセリン耐性の変異率は高く、ナリジクス酸耐性に対して最低であり、リフィンピシン耐性の割合は真ん中にある。
変動アッセイは、どの株が構成的なミューテーターであり、正常な突然変異率を有するかを明確に示す。mutT除去剤株としては、対照MG1655株より約50倍高いナリジクス酸耐性に対する変異率を有していた。このプロトコルを事前に形成しながら、細胞が良好に成長していることを確認します。
同じ環境の並列カルチャ間で均一な密度に成長する必要があります。この手順のフォローアップの1つは、抵抗性コロニーにおけるrpoB遺伝子のDNA配列を決定することです。リフィンピシン耐性に対する変異のスペクトルが環境微生物遺伝子型とどのように変化するかを決定する。
20世紀の変動アッセイは、突然変異が環境に関してどのように自発的かつランダムであるかを示した。今、彼らは突然変異率が遺伝的、生態学的、さらには社会的にも環境によってどのように変化するかについて新たな光を当てています。
