Variantes estruturais como inserções, deleções, duplicações e inversões foram no passado mais difíceis de seguir experimentalmente, e suas frequências não podem ser medidas com precisão por sequenciamento de ampliação. Aqui nós fornecemos uma técnica simples e econômica, que combina o design do primer triplicado e a eletroferese capilar paralela para seguir as frequências alélicas variantes estruturais ao longo do tempo. Este método foi projetado para complementar o sequenciamento de desfechos na evolução experimental e para retraçar as frequências de alelos emergentes de novo.
Esperamos que este método também beneficie aqueles que trabalham com dados intra-hospedeiros de patógenos. Quem demonstrará o procedimento será Jeanne Hamet, assistente de pesquisa do nosso laboratório. As diferentes etapas dos métodos serão mostradas em um caso em que o alelo derivado resulta de uma inserção de IS10 em um gene bacteriano chamado mutS.
Primeiro projete um par de primers para amplificar um amplicon curto no alelo do tipo selvagem ao redor do local de inserção mutante. Projete um terceiro primer forward primer two dentro da sequência de inserção para produzir uma pequena variável de tamanho a partir do amplicon do tipo selvagem. Comece extraindo DNA de culturas de 24 horas de clones de alelos selvagens e mutantes fixos.
Depois de quantificar o DNA, diluir cada extrato de DNA para cinco nanogramas por microlitro com água. Fixe as duas amostras em uma proporção de 50/50. Configure uma reação de 20 microlitros contendo 10 nanogramas de amostra de DNA, primers e mistura mestre de PCR.
Em seguida, separar o produto da PCR por eletroforese, usando um gel de agarose a 2%. A diferença de tamanho entre os amplicons do tipo selvagem e do mutante deve ser verificada no gel. Para obter uma curva de calibração, comece misturando o DNA do tipo selvagem e o DNA mutante em várias proporções.
Diluir os produtos de PCR para 0,1 nanogramas por concentração de microlitro. Para preparar o gel de separação, misture o gel fresco e o corante. Substitua o buffer de entrada.
Coloque o tampão de enxágue na gaveta correta do instrumento de eletroforese capilar paralela. Adicione 22 microlitros do marcador diluente aos poços de uma placa de 96 poços. Agora adicione dois microlitros dos produtos de PCR diluídos a cada poço de amostra.
A um poço, adicione uma escada de tamanho de DNA de um kit de alta sensibilidade, variando de um a 6.000 pares de base de tamanho. Coloque a microplaca no instrumento de eletroforese capilar paralela em execução selecionada no software do instrumento. Analise os resultados utilizando o software de análise de dados.
Primeiro, identifique os picos com base em seu tamanho conhecido. Quantifique cada amplicon para produzir uma curva de calibração. Finalmente, verifique se as quantidades relativas dos dois alelos estão corretamente medidas.
Esta curva de calibração é então usada para calcular a quantidade de variantes estruturais após amplificação por PCR e eletroforese capilar paralela. Estes resultados representativos seguem uma inserção disruptiva no gene mutS. Knockdowns e mutS levam a um fenótipo hipermutador, permitindo que as bactérias apareçam mais mutações do que sua taxa de mutação base.
Usando o método apresentado, a frequência da variante estrutural mutS foi rastreada ao longo de 1000 gerações. Uma trajetória não monotônica do alelo mutante emergente foi revelada. O alelo mutante foi detectado pela primeira vez na geração 680.
O alelo então aumentou rapidamente em frequência, atingindo 67% na geração 713. Este aumento então estagnou, aumentando apenas 10% nas 53 gerações seguintes, para 76% Inesperadamente, a frequência do alelo mutante diminuiu de 76% para 49% ao longo de 13 gerações, após o que aumentou para fixação. Este método beneficiará aqueles que trabalham com evolução experimental.
Esse protocolo permite que o usuário pegue arquivos congelados e explore trajetórias evolutivas que, de outra forma, não são observáveis com dados de sequenciamento de endpoint.
