וריאנטים מבניים כגון החדרות, מחיקות, כפילויות והיפוכים היו בעבר קשים יותר למעקב ניסיוני, ולא ניתן למדוד במדויק את התדרים שלהם על ידי ריצוף אמפליקון. כאן אנו מספקים טכניקה פשוטה וחסכונית, אשר משלבת עיצוב פריימר משולש ואלקטרופרזה נימית מקבילית כדי לעקוב אחר תדרי אלל משתנים מבניים לאורך זמן. שיטה זו נועדה להשלים את ריצוף נקודות הקצה באבולוציה הניסויית ולשחזר את התדרים של אללי דה נובו מתפתחים.
אנו מקווים ששיטה זו תועיל גם לאלה העובדים עם נתוני פתוגן תוך מארחים. מי שתדגים את ההליך תהיה ז'אן המט, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו. השלבים השונים של השיטות יוצגו במקרה שבו האלל הנגזר נובע מהחדרת IS10 לגן חיידקי הנקרא mutS.
ראשית, תכננו זוג פריימרים כדי להגביר אמפליקון קצר על האלל מסוג פרא סביב אתר החדרת המוטנטים. עצבו פריימר פריימר שלישי קדימה שניים בתוך רצף ההחדרה כדי ליצור משתנה גודל קל ממגבר הסוג הפראי. התחילו בחילוץ דנ"א מתרביות של 24 שעות ביממה של שיבוטים קבועים של אללים מסוג בר ומוטנטי.
לאחר כימות הדנ"א, מדללים כל תמצית דנ"א לחמישה ננוגרם למיקרוליטר עם מים. תקן את שתי הדגימות ביחס של 50/50. הגדר תגובה של 20 מיקרוליטר המכילה 10 ננוגרם של דגימת DNA, פריימרים ותערובת מאסטר PCR.
לאחר מכן, להפריד את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה, באמצעות ג'ל agarose 2%. יש לאמת את הבדלי הגודל בין האמפליקונים מהסוג הפראי לבין המוטציה על הג'ל. כדי לקבל עקומת כיול, התחילו בערבוב הדנ"א הפראי והדנ"א המוטנטי ביחסים שונים.
לדלל את מוצרי PCR לריכוז של 0.1 ננוגרם למיקרוליטר. להכנת ג'ל ההפרדה, מערבבים את הג'ל הטרי והצבע. החלף את מאגר הכניסה.
מקם את חיץ השטיפה במיקום המגירה הנכון של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקביל. הוסף 22 מיקרוליטר של סמן מדלל לבארות של צלחת באר 96. עכשיו להוסיף שני מיקרוליטר של מוצרי PCR מדולל לכל מדגם היטב.
לאחד ובכן, להוסיף סולם גודל DNA מתוך ערכת רגישות גבוהה, החל אחד עד 6, 000 זוגות בסיס בגודל. מקם את צלחת המיקרו במכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילה בהפעלה נבחרת על תוכנת המכשיר. נתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.
ראשית, זהה את הפסגות על פי גודלן הידוע. כמת כל אמפליקון כדי ליצור עקומת כיול. לבסוף, ודא כי הכמויות היחסיות של שני האללים נמדדות כראוי.
עקומת כיול זו משמשת לאחר מכן לחישוב כמות הווריאנטים המבניים לאחר הגברת PCR ואלקטרופורזה נימית מקבילית. תוצאות מייצגות אלה עוקבות אחר החדרה משבשת של הגן mutS. Knockdowns ו-mutS מובילים לפנוטיפ היפר-מוטטור, המאפשר לחיידקים לדגום יותר מוטציות משיעור המוטציות הבסיסי שלהם.
באמצעות השיטה שהוצגה, בוצע מעקב אחר תדירות הווריאנטים המבניים mutS לאורך 1000 דורות. נחשף מסלול לא מונוטוני של האלל המוטנטי המתהווה. האלל המוטנטי זוהה לראשונה בדור 680.
לאחר מכן האלל עלה במהירות בתדירותו, והגיע ל-67% בדור 713. עלייה זו קפאה על שמריה, וגדלה רק ב-10% במהלך 53 הדורות הבאים, ל-76%באופן בלתי צפוי, תדירות האלל המוטנטי ירדה אז מ-76% ל-49% במהלך 13 דורות, ולאחר מכן היא עלתה לקיבוע. שיטה זו תועיל לאלה העובדים על אבולוציה ניסיונית.
פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לקחת ארכיונים קפואים ולחקור מסלולים אבולוציוניים שאחרת לא ניתן לצפות בהם עם נתוני ריצוף נקודות קצה.
