このプロトコルは、ブレオマイシンの気管内注射によって両方の肺に重要な炎症および線維性応答を誘導し、尾静脈注入による新しい抗炎症および抗線維化全身療法を検証するために、両方にうまく適用することができる。この技術の主な利点は、マウス気管へのブレオマイシンの直接注入は、肺の炎症性および線維症の安全で堅牢で再現性の誘導を可能にする上気道のこぼれなしで肺の迅速な標的化を保証することである。この手順のデモンストレーションは、私たちの共同研究室の獣医であるフィオレンザ・オーランド博士です。
まず、麻酔用マウスを背中に横たわらせ、外科用プラットフォームに置きます。外科用テープストリップで脚を繊細に固定して所定の位置に保持します。マウスの首をハイパー伸ばすには、歯の綿ロールなどの支持を子宮頸部の下に置きます。
その後、カミソリの刃を使用して、喉をそっと剃ります。解剖学的鉗子のペアを使用して皮膚をつまむ。リング処理された曲線鈍いはさみを使用して、マウスのステノヒョイド筋肉に対応して長さが約半センチメートルの短い切開を行います。
綿毛の棒を使用して出血を止めます。その後、鈍い解剖によって気管を外装し、脂肪や他の組織から穏やかにきれいにします。手術プラットフォームを回転させて、マウスの頭をオペレータに向け、注射中にオペレータが注射器を適切に角度付けできるようにします。
気管を可視化するには、マウスを操作顕微鏡の下に置きます。照明を調整し、1 ~ 1.2 の倍率を設定してから、フォーカスと鮮明度を調整します。気管は、はっきりと見える気管リングを持つ白い半透明のチューブとして容易に区別することができる。
穏やかにピペットはブレオマイシン溶液を混合し、泡形成を避ける25ゲージの針と0.5ミリリットルのシリンジに100マイクロリットルを吸引する。気管が明確に可視化されたら、慎重に30度の角度で針先でそれを穿刺します。気管の内腔に直接ブレオマイシンの100マイクロリットルをゆっくりと注入します。
ボリューム全体が針を下に移動するのを数秒待った後、気管から取り除きます。液体の全容が吸入されたことを示す気管に針が正しく挿入されたときに起こる無呼吸の数秒を観察する。注射器と針を安全に捨てます。
皮下筋膜と皮膚創傷を5-0の吸収性縫合糸で閉じ、動物が回復することを可能にする。再びマウスを麻酔し、意識不明が確認されたら、無菌フードの下にマウスを置きます。実験全体を通して穏やかな麻酔を維持するために1.5%イ皮溶ランの連続流れの顔のマスクを使用しなさい。
血管拡張を促進し、より簡単な注射を可能にするために、2分間暖かい水に尾を浸す。ヒト臍帯間葉間質細胞の懸濁液を、細胞塊の形成を避けるために穏やかにピペット処理することによって混合する。泡形成を回避する26ゲージの針と1ミリリットルのシリンジに200マイクロリットルを吸引する。
尻尾を先端で持ち、そっとまっすぐにします。その後、尾の側面静脈を見つけます。メスで尻尾を軽く削り、70%エタノールで拭きます。
尾の遠位部分から始めて、針を静脈に15度の角度で挿入します。ヒト臍帯間葉間質細胞の200マイクロリットルをゆっくりと注入する。静脈内注入の成功を監視するには、抵抗力がなく静脈に入る液体と、外挿の欠如を観察する。
ボリューム全体が針を下るまで数秒待った後、静脈から取り除きます。その後、出血を防ぎ、動物が回復できるように、滅菌ガーゼで入り口の創傷に圧力をかける。注入後に注射器と針を安全に捨てます。
ブレオマイシン注射後、肺組織病理学的変化を、生理学的変化を、生理食前注射後の通常の肺アーキテクチャと比較して、広範囲の炎症性浸潤および線維症を確認するヘマトキシリンおよびエオシンおよびピクロシリウスレッド染色によって評価された。ブレオマイシン誘発性肺炎症および線維症は、主にヒト臍帯間葉間質間質細胞注入によって減衰したが、生理食糸によっては減衰しなかった。コラーゲン沈着は、ヒドロキシプロリンアッセイにより測定した。
ブレオマイシン注射後、ヒドロキシプロリンレベルは8日目から14日目および21日目まで徐々に増加した。一方、ヒト臍帯間葉間質細胞の添加は、ブレオマイシンの効果を有意に減少させた。Col1A1型1型コラーゲン遺伝子の発現レベルは、肺mRNA全体における1種類のコラーゲン遺伝子も、ヒト臍帯間葉間質細胞処置によって部分的に減少した8日目、14日目および21日目に進行性の増加を示した。
特定の抗体による免疫染色は、ヒト臍帯間葉間質細胞を迅速かつ効果的にマウス肺に注入したことを示したが、検出された細胞はわずかである。これらのデータは、長期の保護効果にもかかわらず、部位損傷からの細胞の急速な脱臼を示唆している。操作顕微鏡の使用はオペレータが正確に取付け前にマウスの気管に針の正しい配置を監視することを可能にすることによって成功の高い信頼を保障し、従ってそれを傷つける危険を最小にする。
