Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

次のプロトコルは、Cの詳細な手順を説明します皮膚が負傷および創傷応答をアッセイするための虫 。 1.ニードル創傷は3,4 <ol><li> E.と標準NGM（線虫の増殖培地）プレート上の健康unstarvedワームを育てる20℃のインキュベーター中で維持食品として大腸菌 OP50細菌。 注：NGM寒天プレートとCのルーチン栽培のための方法エレガンス www.wormbook.org 6で見つけることができます。 </li><li> 20℃CO / Nで負傷し、培養の前に新鮮に播種プレート1日に25 L4ステージワームをピック。 </li><li>負傷する前に、針プラーを使用して、毛細血管から針を引っ張る。創傷に使用する針は、Cのマイクロインジェクションのために使用されるものと同じです虫 。 </li><li>すべてのワームは若い成人の段階であることを確認します。約30分間氷上でワームのプレートを置きます。冷却は、針の創傷を促進する、動物が低迷されます。 <li>解剖実体顕微鏡に氷から寒天プレートを取り外します。ワームのピックを使用して、寒天プレートの中央に25ワームを動かす。 </li><li>より簡単に針を保持するために、100μlのピペットチップに針を置きます。生殖腺を避け、針でワームの本体の前方または後方の部分を穿刺。一般的に、後部咽頭と前方生殖腺の間、または後の生殖腺と直腸の間で巻かしようとします。再使用の針を何度も、それらが破壊されるまで。 注：傷が動物に〜5-10ミクロンを貫通し、キューティクルや皮膚を穿刺簡単な、穏やかな呵責であることを確認してください。針はアニメーションを入力してください皮膚へらほぼ直角。傷は内臓に明らかな損傷、または身体の即時破裂が発生することはありません。傷の後に数秒間滲出細胞質の少量を観察。しかし、細胞内容が長時間にわたって漏れる場合、動物が生存しないであろう。最適な画像化のために、横方向の表皮シンシチウム（hyp7）または横方向の継ぎ目を巻か。 注：この手順は、ガラス針の使用を含む。 </li><li>ワームは20℃で、次に室温で文化を回復できるようにします。以下に記載のアッセイの数によって針創傷の成功を判断する。野生型動物の95％より多くは、針が若年成人段階で創傷後24時間を生き残る。幼虫や高齢者に負傷の影響がまだ広範囲に分析されていない。 </li></ol> 2.レーザー創傷は3 より正確な創傷を実行するためにフェムト秒レーザー照射（800 nm）を使用してください。 <ol><li>寒天Pを準備溶融した2％寒天7とガラススライド上に広告。パッドはCのライブイメージングのために使用される寒天パッドに似ていることを確認虫 。 </li><li>ワームのピックを持つアガロースパッドの上に10若い成虫を転送し、12 mMのレバミゾール液の2μlのドロップを追加。カバースリップで動物や液体をカバーしています。ワームは麻痺させるために1〜2分待ちます。 </li><li>スピニングディスク共焦点顕微鏡上にスライドガラスを置きます。ワームを見つけると100Xの目的とした横方向の前方または後方胞体表皮（NA 1.4から1.46）に焦点を当て、ステージを移動します。 </li><li> （対物前に測定）140 mWまでフェムト秒レーザーのパワーを設定します。 80 MHzのの繰り返し率でフェムト秒レーザーを使用してください。 注：（20ミリ秒で区切られた）200ミリ秒ずつの2つのパルスは、私たちの手の中に負傷のために十分である。 </li><li>表皮細胞の頂端面に焦点を当て、表皮を巻か。細胞質（バブリング）の局部的破壊、またはローカル漂白Oを守って使用する任意の蛍光マーカーF。 注：フェムト秒レーザーを使用するときに、適切なレーザー安全手順に従ってください。このような二光子顕微鏡のものとフェムト秒レーザーを使用して線または点走査は、レーザー創傷のための十分な電力を提供すべきである。 注：私たちは他のレーザーを使用しての直接の経験を持っていないが、原則として創傷に（C. elegansの細胞アブレーションに使用されるような）従来のUVレーザーを使用して可能にする必要があります。必要に応じて、表皮（N.プジョル、私信）を巻きつけ、ディスク共焦点を回転さに（FRAP）モジュールを光退色後の蛍光回復を使用しています。 </li></ol>創傷形成表皮のCa 2+応答の3可視化<ol><li>トランスジェニックC.を使用してください大人の表皮特異的プロモーターCOL-19（ 図1Aの制御の下で、表皮に（そのようなGCaMPシリーズのものなど）のCa 2+センサーを表現する線虫株は、導入遺伝子がにリストされています<stroNG&gt;表1）。そのような導入遺伝子発現レベルの内部対照としてtdTomatoなどの赤色蛍光タンパク質を発現する導入遺伝子を使用してください。 NOTE：表皮tdTomato蛍光が比較的安定しており、GCaMPイメージングと干渉しないように我々は、導入遺伝子発現のための内部コントロールとしてtdTomatoを使用している。 </li><li>表皮にトリガーのCa 2+の上昇が負傷針とレーザーの両方。針創傷容易スピニングディスク共焦点上で実行することができないようしかし、レーザー創傷は、Ca 2+応答（ 図1）の定量分析のために好適である。 </li><li> 100Xの目的とした回転ディスク共焦点（NA 1.4から1.46）と適切なフィルターセットを使用して多次元取得モード（インターバル時間114ミリ秒励起レーザー露光と2秒）でのタイムラプス画像を取得（GFPフィルタがGCaMP3のために動作します）。 注：CA 2+ RESPを調べるために約2時間毎に30秒タイムラプス画像を取得より長い時間経過にわたって負傷にオンセ。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して、表皮細胞の細胞質ゾルおよびバックグラウンドの5つを中心とするそのうちの5つの近隣の10同等の領域（ROI）、平均GCaMP蛍光を測定する。 </li><li>傷害の前に、バックグラウンドで5 ROIの平均を引いた後、表皮における5のROIの蛍光を平均化することにより、ベースライン蛍光（F 0）を取得します。ベースラインに対する変化の比率として蛍光ΔFの変化を表現する[（F tは -F 0）/ F 0]。 </li></ol>創傷後F-アクチンダイナミクスの4可視化<ol><li>注：針創傷に応じて、徐々に傷の周りに閉じ創傷部位でのアクチンリングを観察します。このプロトコルセクションアッセイはアクチンリングの直径を測定することにより、創傷閉鎖。 </li><li>このように融合されたショウジョウバエモエシンアクチン結合ドメインとしてのF-アクチンのマーカーを発現するトランスジェニックワームを生成しますGFPは、（導入遺伝子juIs352）のcol-19（ 図2A）のような表皮特異的プロモーターの制御下で発現される。 注：私たちは、そのようなLifeactまたはF-tractin（未発表の結果）などの他のアクチン結合ドメインマーカーを使用して同様の結果を得た。 </li><li> P COL-19- GFP-モエシンジェニックワームに負傷針を実行します。針創傷後、約5分までに、創傷部位の周りにGFP-モエシンのリングを観察する。アクチンリングは直径が小さくなり、最終的には野生型動物（ 図2A）で負傷2-3時間後を閉じます。 </li><li>スライドガラス上の2％寒天パッドを準備し、2μlの12 mMのレバミゾール溶液にパッドの上に10のワームを転送する。画像GFP-モエシンリング従来の共焦点顕微鏡を用いて創傷後1時間。 注：使用し、共焦点顕微鏡1時間創傷後アクチンリングのzスタック（13×0.5μm）を取得する。 </li><li>創傷後アクチンリング径を測定します。表皮Gを定量するために、FP-モエシン、最初のzスタックの最大強度投影を行ってから、4ラインスキャンを描くGFP-モエシンリング上（互いに45°）。リングの直径は、4つのライン走査（ 図2B）のピーク距離平均ピークとして定義される。すでに閉じられているリングのために、直径が0以下のように定義されている。 注：これは、野生型創傷閉鎖過程を経て約半分の方法であるように、F-アクチンリングが便利に負傷1時間後に測定している。 Fアクチン環はまた、創傷閉鎖の経時変化を導出するために、複数の時点で測定することができる。創傷閉鎖のタイムラプスムービーは、レバミゾールを固定化したワームを使用して、ディスク共焦点顕微鏡を回転さを取得することができる。 </li></ol>表皮抗菌ペプチドの5アッセイの誘導注：創傷はまた、Cの自然免疫応答をトリガー虫の皮。抗菌性ペプチド（AMPS）をコードする遺伝子の転写は、INDです表皮にuced。 NLP-29（神経ペプチド様タンパク質）AMPが強く4を創傷により誘導される。表皮は、創傷後のAMPの発現を制御する方法の個々のAMPの転写レベルを検出するために、トランスジェニックレポーターまたはリアルタイムPCRを使用して、アッセイする。 <ol><li> 4が負傷に対する自然免疫応答のためのトランスジェニックレポーターアッセイ。 </li><li>内部コントロールとしてのP NLP-29- GFP とP COL-12-のDsRedが含まれているトランスジェニックレポーターfrIs7を発現する成体動物に（プロトコル1のように）針創傷を実行します。 GFPロングパスフィルタのような濃い赤やオレンジ無傷成体動物を観察します。 注：野生型のワームが負傷すると、PのNLP-29 -GFP発現を誘導しますが、オレンジ、黄色、またはGFPロングパス照明下で緑色にワームで、その結果、PのCOL-12 -dsRedには影響しません。そのようなPMK-1またはNSY-1な ​​どのp38 MAPK経路における遺伝子の機能の喪失は、NLP-29 -GFPをブロックします4を創傷後誘導。 PのNLP-29- GFPは、幼虫の段階で高いレベルで発現される</li><li>若い成人の動物でAMP誘導アッセイを行う。無傷対照動物は、GFPのレベルが低いことを確認してください。 注：P NLP-29- GFP発現は、浸透圧ストレス8によって誘導され、他の環境ストレスに敏感である。 </li><li>創傷後6時間、GFPロングパスフィルタでスコープを解剖蛍光を用いて、P NLP-29 -GFP誘導（ 図3）9 を持つワームの数をスコア。 注：1時間後創傷のP NLP-29- GFPが目に見えて、ピークから約6時間後に創傷に到達し、誘導された後、24時間後の創傷にまで上昇したままで。視覚的なスコアリング4,9によって発現を定量。あるいは、蛍光活性化セルソーターワーム4を用いて、発現レベルを定量化する。ワームソーターの場合は、少なくとも50の動物が負傷する必要がある。 </li><li>資格でのためのリアルタイムPCRアッセイ個々のAMP遺伝子の転写レベルをntitating。アッセイ転写物のいくつかの遺伝子のためのレベル：NLP-29、NLP-30、CNCの-1、およびCNCの-5。 </li><li>野生型または変異型ワームに負傷針を実行します（プロトコル1を参照） </li><li>希望の時間に50負傷したワームや50無傷ワーム（ 例えば、3、6、24時間）後の創傷を収集します。 </li><li>製造業者の指示に従って市販のキットを用いてRNAを抽出します。 </li><li>商業逆転写酵素キットを用いて全20μlのcDNAを取得するために逆転写を行います。 </li><li> RT-PCRのために、フルオレセインおよび0.2μMのプライマーと緑のスーパーミックスとの組み合わせで各サンプルから0.2μLのcDNA（1/40）を使用します。 RNAの品質を比較するために、参照としてAMA-1またはSNB-1 RT-PCRを使用します。内部統制（AMA-1またはSNB-1）に正規化することにより、AMPの相対発現レベルを比較し、またはノルムで（負傷したワーム/非創傷ワームでAMP誘導）誘導倍率創傷後を比較内部統制にalizing。 注：CNC-1とCNC-5は、その転写が10を負傷によって活性化され、家族の抗菌ペプチドをcaenacinされている。典型的には、針創傷は、4時間10の時間経過にわたる式（CNCの-1〜500倍）を誘導する。発表された研究に用いたプライマーを表2に示す。 </li></ol>創傷後6.アッセイサバイバル<ol><li>注：のCa 2+依存性の創傷修復経路および自然免疫応答経路：創傷は、表皮中に少なくとも2個の独立したシグナル伝達経路を活性化する。両方の経路は、無菌創傷の完全な生存のために必要とされる。変異体またはRNAi治療が創傷治癒に影響するかどうかをテストするには、24〜48時間後に創傷の生存率を測定する。必要に応じて、長寿4,9上負傷の影響を決定するために、従来の寿命アッセイを使用しています。 </li><li> （若年成人（L4 + 24時間）のワームで50ワームを負傷させた針を実行し、リピートセベ上記のプロトコル1以下RAL回）。コントロールとして非創傷ワームの同等の数を維持する。 </li><li>生存ごとに24時間を確認してください（新しい寒天プレートに24時間毎に負傷したワームを転送する）。そのようなGTL-2またはTIR-1、正規化された無傷対照動物にとして創傷修復における欠陥がある変異体において創傷後50％の生存〜24時間を守ってください。死は、ワームのピックによってタッチする運動応答の欠如として定義されている。 </li></ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

針、レーザー創傷のためにここに提示される方法は、損傷を修復する表皮上皮の能力を評価するための補完的なアプローチを提供する。針創傷は表皮、キューティクル、そしておそらく内部基底膜を破壊に対し、レーザー創傷は、表皮に限定することができ、比較的ローカライズと（レーザーの構成に応じて）である。針創傷は、より正確に病原体または自然環境での機械的な損傷によって?...

皮膚創傷治癒のメカニズムは基本的な生物学的興味のものであり、人間の健康に関連する。脊椎動物および哺乳動物における創傷治癒は、複数の組織および1シグナルの協調的応答の複雑な系列を含む。多くの単純な遺伝的モデル生物はまた、皮膚創傷2治癒することができる。これは、皮膚創傷修復の遺伝的に扱いやすいモデルを分析することが重要である。我々と他の人は肌のための新しいモデルは3,4創傷治癒などの線虫（Caenorhabditis elegans）を使用し始めている。このプロトコルの目的は、Cを使用する研究者のより広範なセットを可能にすること表皮の創傷治癒の分子·細胞メカニズムを調べるためのツールとして虫 。 C.虫の皮膚は（また皮下組織として知られている）、表皮および細胞外のキューティクル5を備えている。大人の表皮は最大でシンシチウムkがあるの多核合胞体の数が少ないから形成されているnownとしてhyp7。表皮は、その頂端表面にキューティクルを分泌する簡単な上皮である。皮膚は積極的に皮膚浸透性の病原体から身を守る、小さな傷4を修復することができます。 C.の創傷修復エレガンススキンはすべて、野生型動物は針、又はレーザ照射による局所的な皮膚損傷による小さな刺し傷に耐えることができる生き残るほぼ、ロバストである。C. elegansの皮膚創傷は、表皮自然免疫応答、創傷閉鎖、および瘢痕形成4を含む応答のスイートを、トリガされます。大人の表皮は有糸分裂後で、創傷治癒、上皮増殖または細胞移動とは対照的に、局所的な細胞応答を含む。我々は、皮膚の創傷が膜TRPMチャネルGTL-2と内部のCa 2+を格納3を必要とする、表皮のCa 2+が大きく、持続的な増加を誘発することが示されている。表皮のCa 2+シグナルは、少なくともF-アクチンリングの形成及び閉鎖WOために必要とされるウントサイト。創傷はまた、NLP-29のようなAMPの転写を活性化する自然免疫応答を誘導する。 AMPの創傷誘導性転写は、表皮4に自律的に動作するTIR-1 / PMK-1 p38 MAPキナーゼカスケードに依存している。どちらのCa 2+シグナル伝達経路におけるまたは先天性免疫応答の欠陥は低い生存創傷後につながる。 C.の比較的単純な構造elegansの表皮、in vivoイメージングのためにその遺伝従順および利点は、創傷修復の複数の側面を研究するためにそれを優れたシステムを作る。 針創傷およびレーザー創傷：ここでは、創傷の2つの一般的な方法のためのプロトコルを提示する。ニードル創傷は（針プラー以外）何の特殊な装置を必要とせず、経験で一日あたりのワームの何百もの上で実行することができます。針創傷寒天プレート上で生育した動物に対して行われる。対照的に、レーザー創傷はanes上で実行されるthetized動物はカバーガラスの下のパッド寒天上に搭載されており、損傷に対する細胞応答のライブイメージングに適しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

C. elegansの表皮とキューティクルが負傷に起因する局所的な損傷を修復することができますシンプルで洗練されたスキン層を形成する。このモデルにおける創傷応答および修復の研究は、細胞骨格および組織損傷に対するゲノム応答の我々の理解を照らしている。 C.を創傷に、2つの最も一般的に使用される方法虫の大人の皮膚マイクロインジェクション針、および現地レーザー照射との呵責である。針創傷は、局所的にキューティクル、表皮、および関連する細胞外マトリックスを破壊し、また内部組織を損傷することがあります。より局所的な損傷でレーザー照射をもたらす。創傷は、上昇した表皮のCa 2+（秒分）、創傷部位（1〜2時間）でのアクチン含有環の形成及び閉鎖、抗菌ペプチド遺伝子の上昇転写（2-24含め容易にアッセイした応答の連続をトリガーする時間）、および瘢痕形成。基本的にすべての野生型の大人の動物は、どこに創傷を生き残る創傷修復または他の応答における欠損変異株として生存率の低下を示している。詳細な針とレーザー創傷のためのプロトコル、および定量および創傷応答と修復プロセス（カルシウム動態、アクチン動態、抗菌ペプチドの誘導、および生存）の可視化のためのアッセイが提示されている。

そのようなGCaMPsとしてCAセンサ（ 図1）を用いて可視化などのレーザーやニードル創傷は、表皮のCaレベルが急速かつ持続的上昇をトリガーします。 Caの上昇は数秒以内に発生し、数十分のために上昇したままです。針創傷を再現創傷部位（ 図2）におけるF-アクチンリングの形成をもたらす。これらは、数分以内に表示され、創傷後1〜2時間かけて徐々に近い。アクチ...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K ビュー.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

生物学

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

のてんかんの変異体における発作のためのアッセイをNeurocircuitショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法<em&gt; C。エレガンス</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...