クライオ電子顕微鏡による微小管相互作用タンパク質の構造研究は、細胞のメカニズムを理解するために重要です。クライオEMグリッド上で相互作用するタンパク質に結合した均質な微小管を調製することは、成功に不可欠です。このプロトコルはシンプルで安価であり、クライオ電子顕微鏡に十分な量と品質で翻訳後修飾を制御した微小管を調製することができます。
微小管は非常に温度に敏感です。したがって、解重合を防ぐために微小管含有溶液を暖かく保つことが重要です。はじめに、遺伝子改変HCT116細胞株をDMEM細胞培養培地中で6〜12個のコンフルエントプレートが得られるまで培養する。
10ミリリットルのPBSで細胞をやさしく洗浄し、細胞培養培地を取り除きます。5ミリモルのEDTAを添加した3ミリリットルの氷冷PBSを用いて細胞を室温で5分間インキュベートし、続いてセルスクレーパーを使用して、細胞をプレートから剥離する。氷上で50ミリリットルのチューブに細胞を集め、250 Gで10分間回転させます。
採取した細胞の体積をチューブ上の体積スケールでメモします。採取した細胞ペレットを等量の溶解バッファーに再懸濁し、超音波処理によって細胞を溶解する。超音波処理後、SDS-PAGE分析のために、18マイクロリットルの水と5マイクロリットルの5X SDSサンプルバッファーを含むチューブに2マイクロリットルのライセートを追加します。
残りの溶解細胞を遠心分離管にピペットで入れ、超遠心ローターで摂氏4度で100, 000 Gで1時間回転させて、溶解液を除去します。シリンジを使用して、ペレットと上部の浮遊層を乱すことなく、透明にしたライセートを取り除きます。2マイクロリットルの透明ライセートを、18マイクロリットルの水と5マイクロリットルの5X SDSサンプルバッファーを含むチューブに加えます。
ペレットを注意深くすすぎ、P-10ピペットチップをペレットに通してペレットを少しすくい上げます。次に、200マイクロリットルの水と50マイクロリットルのSDSバッファーを追加します。採取した上清に1ミリモルのGTPと20マイクロモルのパクリタキセルを加えて微小管を重合し、摂氏37度で30分間インキュベートして微小管を組み立てます。
400マイクロリットルの溶解バッファーに600マイクロリットルのグリセロールを加えてクッションバッファーを調製し、混合物に20マイクロモルのパクリタキセルを補充します。バッファーを摂氏37度に予熱します。800マイクロリットルのクッションバッファーを超遠心チューブに追加します。
次に、GTPパクリタキセルを添加したライセートをクッションバッファーの上に注意深くピペットで貼り付けます。チューブを超遠心機ローターに入れて、摂氏30度で100, 000 Gで30分間回転させます。チューブの外側に面した端に印を付けて、微小管ペレットが形成される場所を簡単に認識できるようにします。
遠心分離後、ペレットを乱すことなくピペットを使用してクッションバッファーを注意深く取り除きます。ペレットの隣に溶解バッファーを注意深く加え、チューブを数回回転させてペレットとチューブの壁からできるだけ多くのグリセロールを除去してから、吸引して洗浄ステップを3回繰り返します。洗浄したペレットをカットチップで50マイクロリットルの予熱した再懸濁バッファーに穏やかに再懸濁し、チューブを摂氏37度に置きます。
18マイクロリットルの水に2マイクロリットルの再懸濁ペレット画分と5マイクロリットルの5X SDSサンプルバッファーを加えます。吸い取り紙を取り付けて、プランジフリーザー装置を準備します。デバイスの温度を摂氏30度に設定し、加湿を100%に設定しますデバイスを30分間平衡化させます。
2つのアプリケーションのためにプランジフリーザーの設定を準備します。最初のアプリケーションでは、力を 10、2 秒のブロット時間、0 秒の待機時間に設定します。2番目のアプリケーションでは、フォースを10、6.5秒のブロット時間、および10秒の待機時間に設定します。
カーボン側を上にしてグリッドを金属グローディスチャージャー車両に配置します。クライオ電子顕微鏡(EMグリッド)を30ミリアンペアで60秒間グロー放電します。ポリスチレン容器アセンブリを液体窒素で冷却し、エタンガスを冷たい金属カップに凝縮して、金属カップ内の液体エタンを準備します。
微小管相互作用タンパク質を希釈バッファーで等量に希釈してから、グリッドに適用して細胞濃度を下げます。ミキサーを摂氏37度に置きます。プランジ凍結装置の近くに加熱ブロックがない場合は、絶縁ポリスチレンボックスに暖かい金属ブロックを使用してください。
プランジピンセットでグロー放電グリッドをつかみ、プランジフリーザーにクリックします。液体エタンの入ったポリスチレン容器をプランジフリーザーに入れ、準備したプログラムを実行します。まず、3.5マイクロリットルの微小管溶液をグリッドに塗布します。
急落冷凍庫でグリッドを吸い取ります。その後、すぐに3.5マイクロリットルの希釈タンパク質を塗布します。そして最後に、プランジャーを吸い取り、液体エタンでグリッドを急落させて凍結させます。
グリッドをグリッド収納ボックスに移し、イメージングするまで液体窒素デュワーに保管します。抽出した微小管の品質と濃度をクーマシー染色SDSゲルで評価した。BSA曲線によるP2レーンの約50キロダルトンの微小管バンドの補間から導出された相対BSA量の非線形回帰直線は、ミリリットルあたり1.42ミリグラムの最終濃度を示しています。
これは、分光光度計で2人で測定した数とよく一致します。新たに抽出した微小管を使用して、クライオEMサンプルを作成しました。微小管は顕微鏡写真では無傷で豊富に見えます。
顕微鏡写真あたりの微小管密度は、微小管が互いに交差するのを避けるために高すぎてはいけません。微小管の破損は、微小管が解重合しているか、微小管の濃度が濃すぎることを示しています。MATCAPに結合した微小管は、微小管表面に電子密度の高いドットを特徴とする粗いエッジを有していた。
MATCAP結合微小管とMATCAP非結合微小管も、計算された2Dクラスで区別できました。この方法でクライオEMグリッドを作成することで、特定の相互作用タンパク質に結合した微小管の構造を調べることができます。これは、構造細胞生物学におけるメカニズムのより良い理解につながる可能性があります。
