Kriyo-elektron mikroskobu ile mikrotübül etkileşen proteinlerin yapısal çalışmaları, hücresel mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Bir kriyo-EM ızgarasında etkileşen proteinlere bağlı homojen mikrotübüllerin hazırlanması başarı için çok önemlidir. Bu protokol basit, ucuzdur ve kriyo-elektron mikroskobu için yeterli miktarda ve kalitede kontrollü post-translasyonel modifikasyonlarla mikrotübüllerin hazırlanmasına izin verir.
Mikrotübüller sıcaklığa çok duyarlıdır. Bu nedenle, depolimerizasyonu önlemek için mikrotübül içeren çözeltileri sıcak tutmak önemlidir. Başlamak için, DMEM hücre kültürü ortamında altı ila 12 konfluent plaka elde edilene kadar kültür genetiği değiştirilmiş HCT116 hücre hattı.
Herhangi bir hücre kültürü ortamını çıkarmak için hücreleri 10 mililitre PBS ile nazikçe yıkayın. Beş milimolar EDTA ile desteklenmiş üç mililitre buz gibi soğuk PBS ile hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe ederek ve daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri plakalardan ayırın. Hücreleri buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve 10 dakika boyunca 250 G'de döndürün.
Hasat edilen hücrelerin hacmini, tüp üzerindeki hacimsel ölçekle not edin. Hasat edilen hücre peletini eşit miktarda lizis tamponunda yeniden askıya alın ve sonication ile hücreleri lize edin. Sonikasyondan sonra, SDS-PAGE analizi için, 18 mikrolitre su ve beş mikrolitre 5X SDS numune tamponu içeren bir tüpe iki mikrolitre lizat ekleyin.
Kalan lize hücreleri bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve lizatı temizlemek için ultra santrifüj rotorunda dört santigrat derecede bir saat boyunca 100.000 G'de döndürün. Bir şırınga kullanarak, pelet ve üstteki yüzen tabakayı rahatsız etmeden temizlenmiş lizatı çıkarın. 18 mikrolitre su ve beş mikrolitre 5X SDS numune tamponu içeren bir tüpe iki mikrolitre temizlenmiş lizat ekleyin.
Peletleri dikkatlice durulayın ve bir P-10 pipet ucunu pelet boyunca döndürerek peletin bir kısmını toplayın. Ardından, 200 mikrolitre su ve 50 mikrolitre SDS tamponu ekleyin. Mikrotübülleri polimerize etmek için toplanan bir süpernatantın içine bir milimolar GTP ve 20 mikromolar paklitaksel ekleyin ve mikrotübüllerin bir araya gelmesine izin vermek için 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
400 mikrolitre lizis tamponuna 600 mikrolitre gliserol ekleyerek yastık tamponunu hazırlayın ve karışımı 20 mikromolar paklitaksel ile destekleyin. Tamponu önceden 37 santigrat dereceye ısıtın. Bir ultrasantrifüj tüpüne 800 mikrolitre yastık tamponu ekleyin.
Ardından, GTP-paklitaksel takviyeli lizatı yastık tamponunun üzerine dikkatlice pipetleyin. Tüpü, 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede 100.000 G'de döndürmek için ultra santrifüj rotoruna yerleştirin. Mikrotübül peletinin nerede oluşması gerektiğini kolayca tanımak için tüpün dışa bakan kenarını işaretleyin.
Santrifüjlemeden sonra, pelet rahatsız etmeden bir pipet kullanarak yastık tamponunu dikkatlice çıkarın. Peletin yanına dikkatlice lizis tamponu ekleyin, peletten ve tüpün duvarlarından mümkün olduğunca fazla gliserol çıkarmak için tüpü birkaç kez döndürün ve ardından yıkama adımını üç kez aspire edin ve tekrarlayın. Yıkanmış peleti 50 mikrolitre önceden ısıtılmış yeniden süspansiyon tamponunda kesilmiş bir uçla nazikçe askıya alın ve tüpü 37 santigrat dereceye yerleştirin.
18 mikrolitre suya iki mikrolitre yeniden askıya alınmış pelet fraksiyonu ve beş mikrolitre 5X SDS numune tamponu ekleyin. Kurutma kağıdını takarak daldırma dondurucu cihazını hazırlayın. Cihaz sıcaklığını 30 santigrat dereceye ve nemlendirmeyi %100'e ayarlayınCihazın 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
Daldırma dondurucunun ayarlarını iki uygulama için hazırlayın. İlk uygulama için kuvveti 10, iki saniye lekelenme süresi ve sıfır saniye bekleme süresine ayarlayın. İkinci uygulama için kuvveti 10, 6,5 saniye lekelenme süresi ve 10 saniye bekleme süresine ayarlayın.
Izgaraları karbon tarafı yukarı bakacak şekilde metal kızdırma boşaltma aracına yerleştirin. Kriyo-elektron mikroskobunu veya EM ızgaralarını 60 saniye boyunca 30 miliamperde kızdırma deşarjı. Polistiren kap tertibatını sıvı azotla soğutun ve etan gazını soğuk bir metal kaba yoğunlaştırarak metal bir kapta sıvı etan hazırlayın.
Hücre konsantrasyonunu düşürmek için ızgaralara uygulamadan önce mikrotübül ile etkileşime giren proteini seyreltme tamponu ile eşit hacimde seyreltin. Mikseri 37 santigrat dereceye yerleştirin. Dalma dondurma cihazının yakınında ısıtma bloğu yoksa, yalıtkan bir polistiren kutuda sıcak bir metal blok kullanın.
Dalma cımbızlı parıltılı deşarj ızgarasını alın ve dalma dondurucusuna tıklayın. Polistiren kabı dalma dondurucuya sıvı etan ile yerleştirin ve hazırlanan programdan geçirin. İlk olarak, ızgaraya 3.5 mikrolitre mikrotübül çözeltisi uygulayın.
Dalma dondurucusunun ızgarayı lekelemesine izin verin. Ardından, hemen 3.5 mikrolitre seyreltilmiş protein uygulayın. Ve son olarak, pistonun lekelenmesine ve daldırılmasının ızgarayı sıvı etan içinde dondurmasına izin verin.
Izgaraları bir ızgara saklama kutusuna aktarın ve görüntülemeye kadar sıvı azot Dewar'da saklayın. Ekstrakte edilen mikrotübüllerin kalitesi ve konsantrasyonu Coomassie boyalı SDS jeli ile değerlendirildi. BSA eğrisi ile P2 şeridinde yaklaşık 50 kilodalton mikrotübül bandının enterpolasyonundan türetilen göreceli BSA miktarlarının doğrusal olmayan bir regresyon çizgisi, mililitre başına 1.42 miligramlık bir nihai konsantrasyonu gösterir.
Bu, iki kişi tarafından bir spektrofotometre ile ölçülen sayı ile iyi bir uyum içindedir. Yeni ekstrakte edilen mikrotübüller, kriyo-EM örnekleri yapmak için kullanıldı. Mikrotübüller mikrograflarda sağlam ve bol görünür.
Mikrograf başına mikrotübül yoğunluğu, mikrotübüllerin birbiri üzerinden geçmesini önlemek için çok yüksek olmamalıdır. Kırık mikrotübüller, mikrotübüllerin depolimerize olduğunu veya mikrotübüllerin konsantrasyonunun çok yoğun olduğunu gösterir. MATCAP'a bağlı mikrotübüller, mikrotübül yüzeyinde elektron yoğun noktalarla karakterize pürüzlü kenarlara sahipti.
MATCAP'a bağlı ve MATCAP'a bağlanmamış mikrotübüller, hesaplanan 2D sınıflarında da ayırt edilebilir. Bu yöntemle kriyo-EM ızgaraları yapmak, belirli bir etkileşimli proteine bağlı mikrotübüllerin yapısını incelemeye izin verebilir. Bu, yapısal hücre biyolojisindeki mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
