Gli studi strutturali delle proteine che interagiscono con i microtubuli mediante microscopia crioelettronica sono cruciali per comprendere i meccanismi cellulari. La preparazione di microtubuli omogenei legati a proteine interagenti su una griglia crio-EM è cruciale per il successo. Questo protocollo è semplice, economico e consente di preparare microtubuli con modificazioni post-traduzionali controllate in quantità e qualità sufficienti per la microscopia crioelettronica.
I microtubuli sono molto sensibili alla temperatura. È quindi importante mantenere calde le soluzioni contenenti microtubuli per prevenire la depolimerizzazione. Per iniziare, la coltura ha modificato geneticamente la linea cellulare HCT116 in terreno di coltura cellulare DMEM fino ad ottenere da sei a 12 piastre confluenti.
Lavare delicatamente le cellule con 10 millilitri di PBS per rimuovere qualsiasi terreno di coltura cellulare. Staccare le cellule dalle piastre incubando le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente con tre millilitri di PBS ghiacciato integrato con EDTA da cinque millimolari e, successivamente, utilizzando un raschietto cellulare. Raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri su ghiaccio e girare a 250 G per 10 minuti.
Notare il volume delle celle raccolte con la scala volumetrica sul tubo. Risospendere il pellet cellulare raccolto in un volume uguale di tampone di lisi e cellule di lisa mediante sonicazione. Dopo la sonicazione, per l'analisi SDS-PAGE, aggiungere due microlitri di lisato in una provetta contenente 18 microlitri di acqua e cinque microlitri di tampone campione SDS 5X.
Pipettare le cellule lisate rimanenti in un tubo da centrifuga e ruotare a 100.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius in un rotore ultracentrifugo per eliminare il lisato. Utilizzando una siringa, rimuovere il lisato eliminato senza disturbare il pellet e lo strato galleggiante sulla parte superiore. Aggiungere due microlitri di lisato eliminato in una provetta contenente 18 microlitri di acqua e cinque microlitri di tampone per campioni SDS 5X.
Risciacquare accuratamente il pellet e raccogliere un po 'di pellet facendo roteare una punta di pipetta P-10 attraverso il pellet. Quindi, aggiungere 200 microlitri di acqua e 50 microlitri di tampone SDS. Aggiungere GTP monomolare e paclitaxel 20 micromolari in un surnatante raccolto per polimerizzare i microtubuli e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire ai microtubuli di assemblarsi.
Preparare il tampone cushion aggiungendo 600 microlitri di glicerolo a 400 microlitri di tampone di lisi e integrare la miscela con paclitaxel da 20 micromolari. Preriscaldare il buffer a 37 gradi Celsius. Aggiungere 800 microlitri di tampone per cuscini in un tubo ultracentrifugo.
Quindi, pipettare accuratamente il lisato integrato con GTP-paclitaxel sopra il buffer del cuscino. Posizionare il tubo in un rotore ultracentrifugo per ruotare a 100.000 G a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Segna il bordo rivolto verso l'esterno del tubo per riconoscere facilmente dove dovrebbe formarsi il pellet di microtubuli.
Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il cuscino con una pipetta senza disturbare il pellet. Aggiungere con attenzione il tampone di lisi accanto al pellet, ruotare il tubo alcune volte per rimuovere quanto più glicerolo possibile dal pellet e dalle pareti del tubo, quindi aspirare e ripetere la fase di lavaggio tre volte. Risospendere delicatamente il pellet lavato con una punta tagliata in tampone di risospensione preriscaldato da 50 microlitri e posizionare il tubo a 37 gradi Celsius.
Aggiungere due microlitri di frazione di pellet risospeso in 18 microlitri di acqua e cinque microlitri di tampone campione SDS 5X. Preparare il dispositivo di congelamento a tuffo installando la carta assorbente. Impostare la temperatura del dispositivo su 30 gradi Celsius e l'umidificazione su 100%Consentire al dispositivo di equilibrarsi per 30 minuti.
Preparare le impostazioni del congelatore a immersione per due applicazioni. Per la prima applicazione, impostare la forza su 10, tempo di macchia di due secondi e tempo di attesa di zero secondi. Per la seconda applicazione, impostare la forza su 10, 6,5 secondi di tempo di macchia e 10 secondi di attesa.
Posizionare le griglie con il loro lato in carbonio verso l'alto nel veicolo di scarico a bagliore metallico. Il bagliore scarica la microscopia crioelettronica, o griglie EM, a 30 milliampere per 60 secondi. Raffreddare il gruppo contenitore in polistirolo con azoto liquido e preparare l'etano liquido in una tazza di metallo condensando il gas etano in una tazza di metallo freddo.
Diluire la proteina che interagisce con i microtubuli in uguale volume con tampone di diluizione prima di applicarla alle griglie per abbassare la concentrazione cellulare. Posizionare il mixer a 37 gradi Celsius. Utilizzare un blocco di metallo caldo in una scatola di polistirolo isolante se non è presente alcun blocco riscaldante vicino al dispositivo di congelamento a tuffo.
Prendi una griglia di scarico a bagliore con pinzette a immersione e fai clic su di esse nel congelatore. Posizionare il contenitore di polistirolo con etano liquido nel congelatore e seguire il programma preparato. In primo luogo, applicare 3,5 microlitri di soluzione di microtubuli alla griglia.
Lascia che il congelatore a tuffo asciughi la griglia. Quindi, applicare immediatamente 3,5 microlitri di proteine diluite. E infine, lasciare che lo stantuffo si asciughi e immerga la griglia nell'etano liquido.
Trasferire le griglie in una scatola di stoccaggio della griglia e conservarle in un Dewar di azoto liquido fino all'imaging. La qualità e la concentrazione dei microtubuli estratti sono state valutate mediante gel SDS colorato con Coomassie. Una linea di regressione non lineare delle quantità BSA relative, derivata dall'interpolazione della banda di microtubuli intorno a 50 kilodalton nella corsia P2 con la curva BSA, indica una concentrazione finale di 1,42 milligrammi per millilitro.
Questo concorda bene con il numero misurato con uno spettrofotometro da due persone. I microtubuli appena estratti sono stati utilizzati per realizzare campioni crio-EM. I microtubuli appaiono intatti e abbondanti sulle micrografie.
La densità dei microtubuli per micrografia non dovrebbe essere troppo elevata per evitare che i microtubuli si incrocino l'uno sull'altro. I microtubuli rotti indicano che i microtubuli sono depolimerizzati o che la concentrazione di microtubuli era troppo densa. I microtubuli legati a MATCAP avevano bordi ruvidi caratterizzati da punti densi di elettroni sulla superficie del microtubulo.
I microtubuli legati a MATCAP e non legati a MATCAP potrebbero anche essere distinti nelle classi 2D calcolate. Realizzare griglie crio-EM con questo metodo può permettere di studiare la struttura dei microtubuli legati ad una specifica proteina interagente. Questo può portare ad una migliore comprensione dei meccanismi della biologia cellulare strutturale.
