מחקרים מבניים של חלבונים המתקשרים עם מיקרוטובולים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים חיוניים להבנת מנגנונים תאיים. הכנת מיקרוטובולים הומוגניים הקשורים לחלבונים באינטראקציה על רשת cryo-EM הם קריטיים להצלחה. פרוטוקול זה הוא פשוט, זול, והוא מאפשר להכין microtubules עם שינויים מבוקרים לאחר תרגום בכמות מספקת ואיכות עבור מיקרוסקופ אלקטרונים קריו.
מיקרוטובולים רגישים מאוד לטמפרטורה. לכן חשוב לשמור על חום התמיסות המכילות מיקרוטובולים כדי למנוע דה-פולימריזציה. כדי להתחיל, תרבית מהונדסת גנטית HCT116 קו תאים בתווך תרבית תאי DMEM עד שישה עד 12 לוחות מפגש מתקבלים.
שטפו את התאים בעדינות עם 10 מיליליטר PBS כדי להסיר כל מדיום תרבית תאים. נתקו את התאים מהלוחות על ידי דגירה של התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם שלושה מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת EDTA של חמישה מילימולרי, ולאחר מכן, באמצעות מגרד תאים. לאסוף את התאים בצינור 50 מיליליטר על קרח ולסובב ב 250 גרם במשך 10 דקות.
שים לב לנפח התאים שנקטפו עם קנה המידה הנפחי על הצינור. השהה מחדש את כדורית התא שנקטפה בנפח שווה של חיץ ליזה ותאי ליז על ידי סוניקציה. לאחר סוניקציה, לניתוח SDS-PAGE, הוסף שני מיקרוליטרים של ליזט בצינור המכיל 18 מיקרוליטר מים וחמישה מיקרוליטרים של מאגר דגימת SDS 5X.
פיפטה את התאים הנותרים lysed לתוך צינור צנטריפוגה להסתובב ב 100, 000 G במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס ברוטור אולטרה צנטריפוגה כדי לנקות את הליזט. בעזרת מזרק, מסירים את הליזט המפונה מבלי להפריע לגלולה ולשכבה הצפה מלמעלה. הוסף שני מיקרוליטרים של ליזט מנוקה לצינור המכיל 18 מיקרוליטר מים וחמישה מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS 5X.
שטפו בזהירות את הגלולה וגרפו מעט מהגלולה על ידי ערבול קצה פיפטה P-10 דרך הכדור. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר מים ו -50 מיקרוליטר של חיץ SDS. הוסיפו GTP של מילימולר אחד ו-20 פקליטקסל מיקרומולרי לסופרנאטנט שנאסף כדי לפלמר את המיקרוטובולים ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר למיקרוטובולים להרכיב.
הכינו את חיץ הכרית על ידי הוספת 600 מיקרוליטר גליצרול ל -400 מיקרוליטר של חיץ ליזיס והשלימו את התערובת עם 20 פקליטקסל מיקרומולארי. מחממים מראש את החיץ ל-37 מעלות צלזיוס. הוסף 800 מיקרוליטר של חיץ כרית לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
לאחר מכן, פיפטה את הליזט בתוספת GTP-paclitaxel בזהירות על גבי כרית כרית. מניחים את הצינור ברוטור אולטרה-צנטריפוגה כדי להסתובב ב 100, 000 G ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. סמן את הקצה הפונה כלפי חוץ של הצינור כדי לזהות בקלות היכן אמורה להיווצר גלולת המיקרוטובול.
לאחר הצנטריפוגה, הסירו את חיץ הכרית בזהירות באמצעות פיפטה מבלי להפריע לכדור. בזהירות להוסיף חיץ ליזה ליד הכדור, לסובב את הצינור כמה פעמים כדי להסיר כמה שיותר גליצרול מן הגלולה ואת הדפנות של הצינור, ולאחר מכן לשאוף ולחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים. השהו מחדש את הגלולה שטופה בעדינות עם קצה חתוך בחיץ מתלה שחומם מראש של 50 מיקרוליטר והניחו את הצינור על 37 מעלות צלזיוס.
הוסף שני מיקרוליטרים של מקטע גלולה מרחף מחדש ב- 18 מיקרוליטר מים וחמישה מיקרוליטרים של מאגר דגימת SDS 5X. הכינו את מכשיר המקפיא על ידי התקנת נייר הניקוי. כוונו את טמפרטורת המכשיר ל-30 מעלות צלזיוס ואת רמת הלחות ל-100%אפשרו למכשיר להתאזן למשך 30 דקות.
הכן את ההגדרות של מקפיא צלילה עבור שני יישומים. עבור היישום הראשון, הגדר את הכוח ל -10, זמן כתם של שתי שניות וזמן המתנה של אפס שניות. עבור היישום השני, הגדר את הכוח ל -10, 6.5 שניות זמן כתם ו- 10 שניות זמן המתנה.
הניחו את הרשתות עם צד הפחמן שלהן כלפי מעלה לתוך רכב פריקת זוהר המתכת. זוהר לפרוק את מיקרוסקופ האלקטרונים הקריו-אלקטרונים, או רשתות EM, ב 30 מיליאמפר במשך 60 שניות. מצננים את מכלול מיכל הפוליסטירן בחנקן נוזלי ומכינים אתאן נוזלי בכוס מתכת על ידי עיבוי גז אתאן לכוס מתכת קרה.
יש לדלל את החלבון בעל אינטראקציה מיקרוטובולית בנפח שווה עם מאגר דילול לפני החלתו על הרשתות כדי להוריד את ריכוז התא. מניחים את המיקסר על 18 מעלות. השתמש בלוק מתכת חם בקופסת פוליסטירן מבודד אם אין בלוק חימום ליד מתקן הקפאה צלילה.
תפוס רשת משוחררת זוהרת עם פינצטה צלולה ולחץ אותם לתוך המקפיא. מקם את מיכל פוליסטירן עם אתאן נוזלי במקפיא לצלול ולרוץ דרך התוכנית מוכנה. ראשית, להחיל 3.5 מיקרוליטר של פתרון microtubule על הרשת.
תנו למקפיא לצלול לכתם את הרשת. לאחר מכן, מיד להחיל 3.5 מיקרוליטר של חלבון מדולל. ולבסוף, תנו לבוכנה לכתם ולצלול להקפיא את הרשת באתאן נוזלי.
מעבירים את הרשתות לקופסת אחסון ברשת ומאחסנים אותן בחנקן נוזלי דיואר עד להדמיה. האיכות והריכוז של המיקרוטובולים שחולצו הוערכו על ידי ג'ל SDS מוכתם בקומסי. קו רגרסיה לא ליניארי של כמויות BSA יחסיות, הנגזר מהאינטרפולציה של רצועת המיקרוטובולים סביב 50 קילודלטון בנתיב P2 עם עקומת BSA, מצביע על ריכוז סופי של 1.42 מיליגרם למיליליטר.
זה תואם היטב את המספר שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי שני אנשים. המיקרוטובולים הטריים שחולצו שימשו להכנת דגימות cryo-EM. המיקרוטובולים נראים שלמים ושופעים במיקרוגרפים.
צפיפות מיקרוטובולים למיקרוגרף לא צריכה להיות גבוהה מדי כדי למנוע מהמיקרוטובולים לחצות זה את זה. מיקרוטובולים שבורים מצביעים על כך שהמיקרוטובולים עוברים דה-פולימריזציה, או שריכוז המיקרוטובולים היה צפוף מדי. מיקרוטובולים הקשורים ל-MATCAP היו בעלי קצוות מחוספסים המאופיינים בנקודות צפופות אלקטרונים על פני השטח של המיקרוטובול.
ניתן להבחין בין מיקרוטובולים הקשורים ל- MATCAP לבין מיקרוטובולים שאינם קשורים ל- MATCAP גם במחלקות הדו-ממדיות המחושבות. יצירת רשתות cryo-EM בשיטה זו יכולה לאפשר ללמוד את המבנה של מיקרוטובולים הקשורים לחלבון אינטראקציה ספציפי. זה יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים בביולוגיה מבנית של התא.
