Структурные исследования белков, взаимодействующих с микротрубочками, с помощью криоэлектронной микроскопии имеют решающее значение для понимания клеточных механизмов. Получение гомогенных микротрубочек, связанных с взаимодействующими белками на крио-ЭМ-сетке, имеет решающее значение для успеха. Этот протокол прост, дешев и позволяет готовить микротрубочки с контролируемыми посттрансляционными модификациями в достаточном количестве и качестве для криоэлектронной микроскопии.
Микротрубочки очень чувствительны к температуре. Поэтому важно держать растворы, содержащие микротрубочки, теплыми, чтобы предотвратить деполимеризацию. Для начала культивируют генетически модифицированную клеточную линию HCT116 в среде для культивирования клеток DMEM до тех пор, пока не будет получено от шести до 12 сливающихся пластин.
Аккуратно промойте клетки 10 миллилитрами PBS, чтобы удалить любую среду для культивирования клеток. Отделите клетки от планшетов, инкубируя клетки в течение пяти минут при комнатной температуре с тремя миллилитрами ледяного PBS, дополненного пятимиллимолярной ЭДТА, а затем с помощью клеточного скребка. Соберите клетки в 50-миллилитровую пробирку на льду и вращайте при 250 G в течение 10 минут.
Обратите внимание на объем собранных клеток с помощью объемной шкалы на трубке. Ресуспендировать собранную клеточную гранулу в равном объеме буфера лизиса и лизировать клетки ультразвуком. После обработки ультразвуком для анализа SDS-PAGE добавьте два микролитра лизата в пробирку, содержащую 18 микролитров воды и пять микролитров 5-кратного буфера образца SDS.
Поместите оставшиеся лизированные клетки в центрифужную пробирку и вращайте при 100 000 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в роторе ультрацентрифуги, чтобы очистить лизат. С помощью шприца удалите очищенный лизат, не нарушая гранулы и плавающий слой сверху. Добавьте два микролитра очищенного лизата в пробирку, содержащую 18 микролитров воды и пять микролитров буфера для образцов 5X SDS.
Тщательно промойте гранулы и зачерпните немного гранул, проведя наконечником пипетки P-10 через гранулы. Затем добавьте 200 микролитров воды и 50 микролитров буфера SDS. Добавьте один миллимолярный ГТФ и 20 микромолярный паклитаксел в собранную надосадочную жидкость для полимеризации микротрубочек и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы микротрубочки могли собраться.
Приготовьте буфер-подушку, добавив 600 микролитров глицерина к 400 микролитрам буфера для лизиса, и дополните смесь 20-микромолярным паклитакселом. Разогрейте буфер до 37 градусов по Цельсию. Добавьте 800 микролитров буфера-подушки в ультрацентрифужную пробирку.
Затем осторожно нанесите пипеткой лизат с добавлением ГТФ-паклитаксела поверх буфера-подушки. Поместите трубку в ротор ультрацентрифуги, чтобы она вращалась при 100 000 G при 30 градусах Цельсия в течение 30 минут. Отметьте обращенный наружу край трубки, чтобы легко распознать, где должна образоваться гранула микротрубочки.
После центрифугирования осторожно удалите буфер-подушку с помощью пипетки, не нарушая гранулы. Осторожно добавьте буфер лизиса рядом с гранулой, поверните трубку несколько раз, чтобы удалить как можно больше глицерина из гранулы и стенок трубки, а затем аспирируйте и повторите этап промывки три раза. Аккуратно ресуспендируйте промытые гранулы с помощью обрезанного наконечника в предварительно разогретом буфере ресуспендирования объемом 50 микролитров и поместите пробирку при температуре 37 градусов Цельсия.
Добавьте два микролитра ресуспендированной фракции гранул в 18 микролитров воды и пять микролитров буфера для образцов 5X SDS. Подготовьте устройство погружной морозильной камеры, установив промокательную бумагу. Установите температуру устройства на 30 градусов по Цельсию и увлажнение на 100%Дайте устройству уравновеситься в течение 30 минут.
Подготовьте настройки погружной морозильной камеры для двух применений. Для первого применения установите усилие на 10, время блоттинга в две секунды и время ожидания в нулевую секунду. Для второго применения установите усилие на 10, время промокания 6.5 секунд и время ожидания 10 секунд.
Поместите решетки карбоновой стороной вверх в металлический автомобиль с тлеющим разрядником. Тлеющий разряд криоэлектронной микроскопии или ЭМ-сеток со скоростью 30 миллиампер в течение 60 секунд. Охладите сборку контейнера из полистирола жидким азотом и приготовьте жидкий этан в металлической чашке, конденсировав газообразный этан в холодную металлическую чашку.
Разбавьте белок, взаимодействующий с микротрубочками, в равном объеме буфером для разбавления, прежде чем наносить его на сетки, чтобы снизить концентрацию клеток. Поставьте миксер на 37 градусов по Цельсию. Используйте теплый металлический блок в изоляционном полистирольном коробе, если рядом с устройством погружной заморозки нет нагревательного блока.
Возьмите светящуюся разряженную сетку пинцетом и вставьте их в морозильную камеру. Поместите емкость из полистирола с жидким этаном в погружную морозильную камеру и пропустите подготовленную программу. Сначала нанесите на сетку 3,5 микролитра раствора микротрубочек.
Пусть морозильная камера промокнет сетку. Затем сразу же нанесите 3,5 микролитра разбавленного белка. И, наконец, дайте поршню промокнуть и погрузить решетку в жидкий этан.
Перенесите решетки в ящик для хранения сетки и храните их в жидком азоте Дьюара до получения изображения. Качество и концентрацию экстрагированных микротрубочек оценивали с помощью геля SDS, окрашенного по Кумасси. Нелинейная регрессионная линия относительных величин BSA, полученная в результате интерполяции полосы микротрубочек около 50 килодальтон в полосе P2 с кривой BSA, указывает на конечную концентрацию 1,42 миллиграмма на миллилитр.
Это хорошо согласуется с числом, измеренным спектрофотометром двумя людьми. Свежеизвлеченные микротрубочки были использованы для изготовления крио-ЭМ-образцов. Микротрубочки выглядят неповрежденными и обильными на микрофотографиях.
Плотность микротрубочек на микрофотографию не должна быть слишком высокой, чтобы избежать пересечения микротрубочек друг с другом. Сломанные микротрубочки указывают на то, что микротрубочки деполимеризованы или что концентрация микротрубочек была слишком плотной. Микротрубочки, связанные с MATCAP, имели шероховатые края, характеризующиеся электронно-плотными точками на поверхности микротрубочек.
MATCAP-связанные и MATCAP-несвязанные микротрубочки также могут быть выделены в расчетных 2D-классах. Создание крио-ЭМ сеток с помощью этого метода может позволить изучить структуру микротрубочек, связанных со специфическим взаимодействующим белком. Это может привести к лучшему пониманию механизмов структурной клеточной биологии.
