Estudos estruturais de proteínas que interagem com microtúbulos por microscopia crio-eletrônica são cruciais para a compreensão dos mecanismos celulares. A preparação de microtúbulos homogêneos ligados a proteínas interativas em uma grade crio-EM é crucial para o sucesso. Este protocolo é simples, barato e permite preparar microtúbulos com modificações pós-traducionais controladas em quantidade e qualidade suficientes para microscopia crioeletrônica.
Os microtúbulos são muito sensíveis à temperatura. Portanto, é importante manter as soluções contendo microtúbulos aquecidas para evitar a despolimerização. Para começar, o cultivo de linhagem celular HCT116 geneticamente modificada em meio de cultura de células DMEM até a obtenção de seis a 12 placas confluentes.
Lave as células suavemente com 10 mililitros de PBS para remover qualquer meio de cultura celular. Separar as células das placas incubando-as por cinco minutos à temperatura ambiente com três mililitros de PBS gelado suplementado com EDTA de cinco milimolares e, posteriormente, usando um raspador celular. Recolher as células num tubo de 50 mililitros sobre gelo e girar a 250 G durante 10 minutos.
Observe o volume das células colhidas com a escala volumétrica no tubo. Ressuspender o pellet de células colhidas em igual volume de tampão de lise e células lisas por sonicação. Após a sonicação, para análise de SDS-PAGE, adicionar dois microlitros de lisado em um tubo contendo 18 microlitros de água e cinco microlitros de tampão de amostra SDS 5X.
Pipetar as células lisadas restantes em um tubo de centrífuga e girar a 100.000 G por uma hora a quatro graus Celsius em um rotor ultracentrífugo para limpar o lisado. Usando uma seringa, remova o lisado limpo sem perturbar o pellet e a camada flutuante por cima. Adicione dois microlitros de lisado limpo em um tubo contendo 18 microlitros de água e cinco microlitros de tampão de amostra 5X SDS.
Enxágue cuidadosamente o pellet e retire um pouco do pellet girando uma ponta de pipeta P-10 através do pellet. Em seguida, adicione 200 microlitros de água e 50 microlitros de tampão SDS. Adicionar GTP de um milimolar e 20 paclitaxel micromolar em um sobrenadante coletado para polimerizar os microtúbulos e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir que os microtúbulos se reúnam.
Prepare o tampão de almofada adicionando 600 microlitros de glicerol a 400 microlitros de tampão de lise e complemente a mistura com 20 micromolares de paclitaxel. Pré-aqueça o tampão a 37 graus Celsius. Adicione 800 microlitros de tampão de almofada a um tubo de ultracentrífuga.
Em seguida, pipetar o lisado suplementado com GTP-paclitaxel cuidadosamente sobre o tampão da almofada. Coloque o tubo em um rotor ultracentrífugo para girar a 100.000 G a 30 graus Celsius por 30 minutos. Marque a borda voltada para fora do tubo para reconhecer facilmente onde o pellet de microtúbulo deve se formar.
Após a centrifugação, remova o tampão da almofada cuidadosamente usando uma pipeta sem perturbar o pellet. Adicione cuidadosamente o tampão de lise ao lado do pellet, gire o tubo algumas vezes para remover o máximo de glicerol possível do pellet e das paredes do tubo e, em seguida, aspirar e repetir a etapa de lavagem três vezes. Ressuspenda o pellet lavado suavemente com uma ponta de corte em tampão de ressuspensão pré-aquecido de 50 microlitros e coloque o tubo a 37 graus Celsius.
Adicione dois microlitros de fração de pellet ressuspendida em 18 microlitros de água e cinco microlitros de tampão de amostra 5X SDS. Prepare o dispositivo congelador de imersão instalando o papel mata-borrão. Ajuste a temperatura do dispositivo para 30 graus Celsius e a umidificação para 100%Deixe o dispositivo se equilibrar por 30 minutos.
Prepare as configurações do congelador de imersão para duas aplicações. Para o primeiro aplicativo, defina a força como 10, tempo de blot de dois segundos e tempo de espera de zero segundo. Para a segunda aplicação, defina a força para 10, 6,5 segundos de tempo de blot e 10 segundos de tempo de espera.
Coloque as grades com seu lado de carbono para cima no veículo descarregador de brilho metálico. O brilho descarrega a microscopia crio-eletrônica, ou grades EM, a 30 miliamperes por 60 segundos. Resfrie o conjunto do recipiente de poliestireno com nitrogênio líquido e prepare o etano líquido em um copo de metal condensando o gás etano em um copo de metal frio.
Diluir a proteína de interação dos microtúbulos em igual volume com tampão de diluição antes de aplicá-la nas grades para diminuir a concentração celular. Coloque o misturador a 37 graus Celsius. Use um bloco de metal quente em uma caixa de poliestireno isolante se não houver bloco de aquecimento perto do dispositivo de congelamento de imersão.
Pegue uma grade descarregada de brilho com pinças de mergulho e clique-as no congelador de imersão. Posicione o recipiente de poliestireno com etano líquido no congelador de imersão e percorra o programa preparado. Primeiro, aplique 3,5 microlitros de solução de microtúbulos na grade.
Deixe o congelador de imersão manchar a grade. Em seguida, aplique imediatamente 3,5 microlitros de proteína diluída. E, por último, deixe o êmbolo manchar e mergulhar, congele a grade em etano líquido.
Transfira as grades para uma caixa de armazenamento de grade e armazene-as em um Dewar de nitrogênio líquido até a obtenção de imagens. A qualidade e concentração dos microtúbulos extraídos foram avaliadas por gel de SDS corado com Coomassie. Uma reta de regressão não linear das quantidades relativas de SC, derivada da interpolação da banda de microtúbulos em torno de 50 quilodalton na pista P2 com a curva BSA, indica uma concentração final de 1,42 miligrama por mililitro.
Isso concorda bem com o número medido com um espectrofotômetro por duas pessoas. Os microtúbulos recém-extraídos foram utilizados para confecção de amostras de crio-EM. Os microtúbulos parecem intactos e abundantes nas micrografias.
A densidade de microtúbulos por micrografia não deve ser muito alta para evitar que os microtúbulos se cruzem uns sobre os outros. Microtúbulos quebrados indicam que os microtúbulos estão despolimerizados, ou que a concentração de microtúbulos foi muito densa. Os microtúbulos ligados ao MATCAP tinham bordas rugosas caracterizadas por pontos elétron-densos na superfície dos microtúbulos.
Microtúbulos ligados a MATCAP e não ligados a MATCAP também puderam ser distinguidos nas classes 2D calculadas. Fazer grades crio-EM com este método pode permitir estudar a estrutura de microtúbulos ligados a uma proteína interagindo específica. Isso pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos em biologia celular estrutural.
