私たちの研究は、主にDNA修復と老化の関係に焦点を当てています。具体的には、さまざまなラミノパチー障害に注目し、それらがDNA修復にどのように影響するかを学びたいと考えています。私たちは、ハッチンソン・ギルフォード早老症症候群として知られる早期老化と短寿命に関連するラミノパシー障害が、実際にはDNA損傷の量の増加と不正確なDNA修復と関連していることを示しました。
当研究室では、ラミノパチー患者に対する治療法の可能性について調査し、これらのアプローチがDNA修復やDNA損傷にもプラスの影響を与えるかどうかを知りたいと考えています。まず、鉗子を使用して滅菌6ウェルプレートの各ウェルに1枚のカバースリップを置きます。2ミリリットルのサプリメントであるDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。
フラスコで培養したHeLa細胞から培地を吸引し、15ミリリットルのPBSを添加して細胞を洗浄します。フラスコを静かに渦巻いて細胞を洗浄し、PBSを吸引し、2ミリリットルのトリプシン-EDTAを加えて細胞をコーティングします。トリプシンでコーティングしたフラスコを摂氏37度および5%二酸化炭素加湿インキュベーターに2分間置き、細胞が剥離するのを待ちます。
次に、トリプシン処理した細胞が入ったフラスコに8ミリリットルのDMEMを添加し、ピペットで数回上下させて凝集細胞を分離します。フラスコから細胞懸濁液を15ミリリットルのポリスチレンチューブに集めます。細胞を数えた後、500, 000個の細胞を6ウェルプレートの各カバースリップに直接一滴ずつ加えます。
プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターに入れ、細胞が一晩成長するのを待ちます。細胞固定のために、翌日6ウェルプレートのウェルから培地を吸引します。各ウェルに2ミリリットルのPBSを加えて細胞を洗浄し、ウェルからすべてのPBSを完全に吸引します。
次に、2ミリリットルの4%ホルムアルデヒド溶液を各ウェルに室温で10分間加え、ウェルから溶液を完全に吸引します。次に、各ウェルに2ミリリットルの透過処理溶液を加えます。溶液を室温で10分間放置し、その後完全に吸引します。
各ウェルに2ミリリットルのPBSを入れて細胞を3回洗浄します。洗濯のたびに完全に吸引してください。すべてのPBSをウェルから吸引したら、各ウェルに2ミリリットルの抗体希釈バッファー(ADB)を添加して、免疫蛍光染色のために細胞をブロックします。
室温で30分間インキュベートし、眼窩を穏やかに振盪します。ブロッキング期間の終わりに向かって。ADBでルーメンB1と二本鎖DNA抗体を混合して、一次抗体希釈液を調製します。
インキュベーションの最後に、井戸からADBを吸引します。パラフィンフィルムを平らな面にテープで貼り付け、処理するすべてのカバースリップを収容するのに十分な大きさの領域を確保します。各カバースリップについて、希釈した一次抗体75マイクロリットルをパラフィンフィルムにピペットで移し、気泡を避けます。
鉗子を使用して、各カバースリップセルを下にして抗体液滴上に置きます。インキュベーティングカバースリップを6ウェルプレートの蓋で覆い、カバースリップを室温で1時間インキュベートします。次に、鉗子を使用して、パラフィンフィルムからカバースリップを慎重に取り除き、細胞側を上に向けて6ウェルプレートに戻します。
カバースリップを2ミリリットルのPBSTで5分間3回振って洗います。最終洗浄では、二次抗体希釈液を調製します。最後の洗浄後、PBSTを完全に吸引します。
パラフィルムに二次抗体を添加し、細胞側を下にしてパラフィンフィルム上にカバースリップを置きます。次に、カバースリップに光保護カバーをかぶせて細胞を光から保護し、室温で30分間インキュベートします。鉗子を使用して、パラフィンフィルムからカバースリップを慎重に取り除き、細胞側が上を向いていることを確認しながら、6ウェルプレートに戻し、次にカバースリップを脱水します70%90%と100%エタノールのそれぞれ2ミリリットルを順次ウェルに追加し、各溶液を1〜2分間放置してから除去します。
鉗子を使用して、カバースリップをウェルから取り外し、糸くずの出ないワイプの上に置いて、光から保護して自然乾燥させます。カバースリップ1枚あたり20マイクロリットルの封入剤を使用して、カバースリップのセル側を下にしてガラス顕微鏡スライドに取り付けます。核ブレブは、HeLa ZMPST24ノックアウト細胞でより一般的であり、核の約50%がブレブを示したのに対し、HeLa制御細胞では17%でした。
DNA漏出は主にHeLa ZMPSTE24ノックアウト細胞で観察されましたが、HeLa制御細胞ではDNA漏出は観察されませんでしたが、一部のZMPSTE24ノックアウト細胞では、目に見える核ブレブがない場合でもDNA漏出が発生しました。
