감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

요약

달걀 주위에 계란과 세포외 코팅 자주 정자와 통신이이를 수정을 홍보 계란 그들을 안내하는 것을 펩티드, 단백질, 작은 분자를 놓습니다. 정자의 누적 assays와 정자 추적 assays - 우리가 정자 chemoattraction를 감지하는 데 사용되는 assays 두 가지 클래스를 설명하고 비교 개구리 정자를 사용하여.

초록

무척추 동물의 정자 chemoattraction 하나는 정자 서스펜션에 매력적인 펩티드를 포함하는 피펫을 배치하고 미세 피펫 ^{1 시경} 정자 축적을 시각화 수있는 충분한 강력한하실 수 있습니다. 같은 개구리, 설치류 동물과 인간과 같은 척추 동물의 정자 chemoattraction 감지하기가 더 어렵습하고 양적 assays가 필요합니다. chemoattractant의 소스, 이른바 정자의 누적 assays, 실제로 개별적인 정자의 수영 궤도를 추적 assays하기 위해 정자의 움직임을 quantitate assays - 이러한 assays는 크게 두 가지 유형의 수 있습니다.

정자의 누적 assays하므로 선량 반응 곡선 및 시간 코스가 상대적으로 빠르게 진행 될 수 있도록 비교적 빠른 있도록 수십 또는 하루에 할 수 assays 수백 있습니다. assays 이러한 종류의 많은 잘 설립 chemoattraction 시스템을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되었습니다 - BAC에 예를 들어, 호중구은 chemotaxisfollicular 유체에 terial 펩티드와 정자의 chemotaxis. 정자 추적 assays 집중보다 노동 수 있지만 chemoattractancts 실제로 정자가 들어있는 수영장 경로를 변경 방법에 대한 자세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 분석의이 유형은 chemoattrractant 그라데이션 축에 비해 정자 운동의 방향을 설명하고 특성을 전환하거나 달걀에 가깝게 정자를 가지고 방향의 변화를 시각화하기 위해 필요합니다.

여기 assays 이러한 두 가지 유형의 각각의 사용 방법을 설명합니다. 활용 정자 축적 분석은 "두 챔버"분석이라고합니다. 수륙 양용의 정자는 12 μm의 직경의 모공을 가진 폴리 카보 네이트 필터 층과 조직 문화 플레이트 삽입에 배치됩니다. 정자와 삽입물은 버퍼와 신중하게 바닥이 벽을 (그림을 참조하십시오. 1) '요건을 충족하고 잘 하단에 pipetted chemoatttractant를 포함하는 조직 문화 판 우물에 게재됩니다. 부화 후, 정자 저수지를 포함하는 상위 삽입은 신중하게 r이된다막 통과가 아래쪽 챔버에 emoved, 그리고 정자가 제거 pelleted 후 hemocytometer 또는 흐름 cytometer로 계산됩니다.

정자 추적 분석은 원래 호중구의 chemotaxis을 준수를위한 개발 Giojalas 동료 ^2,3에 의해 정자의 관찰에 대한 수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. 챔버는 두 세로 골짜기가 가공되어이있는에 두꺼운 유리 슬라이드로 구성되어 있습니다. 이들은 1mm 폭 전망대로 구분됩니다. 커버 유리, 정자의 응용 프로그램을 하나의 구유에로드되고 나면, 개별 정자의 다른과 운동으로 chemoattractant 에이전트 비디오 현미경에 의해 시각. 비디오 영상은 다음 각 정자의 궤도를 형성 시간 (xyt 데이터 세트)의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포 움직임을 파악하는 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

프로토콜

1. 재료 및 사용된 버퍼

1. Oocyte에 울리는의 버퍼 (1.5 X OR2)는 124 MM NaCl, 3.75 MM KCl, 1.5 MM CaCl _2, MgCl ₂ 1.5 MM 1.5 MM 나 ₂ HPO _4, 10 MM Hepes를 포함 산도 7.8. 수정 버퍼 (F - 1)은 41.25 MM NaCl, 1.25 MM KCl, 0.25 MM CaCl _2, 0.06 MM MgCl _2, 0.5 MM 나 ₂ HPO _4, 2.5 MM Hepes, 산도 7.8이 포함되어 있습니다.
2. Xenopus laevis 계란 물을 스기야마 외에 따라 준비가되어 있습니다. ^4. 간단히 설명, 갓 양산 젤리 개구리 알을 30 분 micropipette에 의해 제거 에어컨 매체에 F - 1 버퍼의 작은 볼륨에서 swirled 있습니다. "계란 물"을 칭했다이 매체는 또한 정제된 allurin이 젤리 추출물의 기본 chemoattractant를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 정자는 상업 자란 Xenopus laevis 또는 Xenopus tropicalis에서 얻을 수 있습니다.
3. t에 필요한 특정 항목에 대한 자료 표를 참조그는 분석.

2. 개구리 정자 chemotaxis에 대한 두 개의 챔버 분석

1. 안락사를 위해 카보런덤 깨끗 가위의 쌍을, 그리고 두 힘을 사용하여 목을 벨, 0.07 % benzocaine를 포함한 물에 침수하여 개구리를 마취. 멀리 근육을 폭로 복부 피부를 자르고. 복부 근육의 중간선과 측면 상처를 확인하고 철회. 부드럽게 창자과 흰색, 콩 모양 testes을 나타내기 위해 지방을 철회. 멀리 혈관을 피하기 위해주의되는 좋은 가위를 사용하여 결합 조직을 낸다. , testis을 제거 1.5 X OR2 버퍼를 사용하여 혈액을 멀리 세척 후 초과 버퍼와 작은 자기편 혈관을 제거하는 필터를 종이에 testis를 롤 후 1.5 X OR2 버퍼의 0.2 ML의 플라스틱 pitre 요리에 testis를 놓습니다. 1.5 X OR2 버퍼 2 ML과 5 ML의 주사기를 채우기, 부드럽게 한 끝에 표면의 대부분에 걸쳐 testis에서 10-20 구멍을 찌를 반대 끝에 바늘을 삽입하고 부드럽게 정자를 제거 버퍼를 삽입. 또는, 한정자를 제거 출구 구멍을 파고있는 동안 버퍼를 삽입하실 수 있습니다. 얼음에 절단 microcentrifuge 튜브에 팁 (정자의 전단을 피하고), 장소와 micropipette를 사용하여 정자 현탁액을 전송합니다.
2. 1.5 X 또는 - 2에서 정자 1:100을 diluting와 혼합 정자 현탁액의 20 μl 채취하고 hemocytometer 및 대형 ^1mm이 영역을 사용하는 세포의 수를 계산하여 얻은 개구리 정자의 수를 예상하고있다. hemocytometer 개수 및 샘플링 비율을 사용하면 정자의 밀도와 수확한 정자의 총 수를 계산합니다. 이 합계는 보통 2 - 2에 대한 ML의 볼륨 6 X 10 ⁷ 정자 두 testes를 사용하는 경우. 2 × 10 ⁷ / ML의 정자 밀도를 구하는 1.5 X OR2 버퍼 재고 정자 현탁액을 희석. 준비 2 ~ 3 시간 이내에 분석을 위해 정자를 사용합니다. 위상 콘트라스트 광학를 사용하여 F - 1 버퍼와 시각 운동과 정자 1시 10분 5 μl를 diluting하여 정자의 운동성을 평가합니다. 정자의 적어도 40 %까지 50%운동성이있는하여야한다. 심지어 적절한 준비가 유치해 대부분의 immotile 정자 많은이 포함됩니다.
3. 각 우물에 F1 버퍼 700 μl를 micropipetting하여 새 24 잘 플라스틱 조직 문화 플레이트를 준비합니다. 각 우물 바닥에 직경 약 15 mm해야합니다.
4. 삼투 충격에 의해 정자 운동성를 활성화하기 위해 microcentrifuge 튜브 (° C 23-21 정도) 실온에서 F1 버퍼의 900 μl와 정자 서스펜션의 100 μl를 diluting하여 assays 일련의를 시작합니다. 때마다 신선한 정자가이 방식으로 활성화되어, 정자가 1-2분 이내에 사용하셔야합니다.
5. 로 12 μm의 다공성 삽입을 (12mm OD) 장소 버퍼 채워진 잘, 삽입 위치가 한쪽으로 공간을두고 중심을 벗어난 있는지 확인하십시오. 즉시 차단 팁을 가지고 micropipette에 의해 우물에 운동성 정자 활성화 400 μl를 전송합니다. 필터 삽입의 벽에 정자 서스펜션을 적용하고 일의 하단에있는 필터에 아래로 실행할 수E 삽입, 정자 정지는 필터에 직접 pipetted해서는 안됩니다.
6. 잘 그리고 오프 센터 필터를 삽입 사이의 공간에 잘으로 chemoattractant 에이전트 조심스럽게 micropipette 50 μl. 하나는 잘의 측면과 하단이 시스템없이 소란과 피펫을 충족하고 철회 드롭을 입금 주의해야합니다. 특히, micropipette에있는 플런저는 완전히 샘플 있지만 공기 방울을 추출을 줄 수있는만큼 첫 번째 중단 강요한다.
7. 시작 첫 번째 분석은 50 분 incubated 때까지 필요한만큼 assays를 시작하는 단계 2.5 이상 2.6 반복 후 접시를 품어. 일반적으로, 하나는 검정 모든 45-60초 시작할 수 있습니다. 분석이 경험이 사람이나 함께 일하는 두 사람에 의해 간소 수 있습니다. 이 경우, assays 중 하나 또는 두 개의 행을 큰 운동성이있는 정자 재고하고 정자를 제공하는 빠른 pipetting과 함께 시작할 수는 항상 1 ~ 2 분 이내에 사용됩니다활성화.
8. 순서의 각 분석 시작 중지합니다. 첫째, 신중하게 꾸준한 한손과 다른과 필터를 삽입 신중 대부분을 제거하거나 모든 micropipette 또는 파스퇴르 피펫로 흡입하여 상부 챔버의 정자 정지. 즉시 벌금 족집게를 사용하여, 필터 삽입을 뽑아 및 폐기. 보험이 단계에서 사용해야합니다, 최소한 남아있는 정자는 artifactually 정자 통과를 위해 가치를 높이는 필터를 통해 휩쓸 수 있습니다.
9. 물론 각각의 접시에서, microcentrifuge 튜브에 전체 정자 현탁액을 전송할 수 있습니다. 정자 바닥에 정착하는 경향이 이후 탈퇴 전에 우물 정자 현탁액을 혼합하는 것이 중요합니다. 0.5 % V / V의 최종 농도 25 %의 포름 알데히드의 15 μl를 추가하고 정자 카운트는 당일 완료되지 않을 경우 냉장.
10. 펠렛 2000의 최대 속도를 가지고 개인적인 microcentrifuge에 십초 푸시 버튼 스핀을 사용하여 각 튜브에있는 정자 X G. 제외한 모든 supernat 100 μl를 제거각 튜브의 개미는 해당 볼륨에있는 펠렛을 resuspend. , 정자 서스펜션 20 μl를 증류수로 1시 10분을 희석하고, 직립 현미경에 40x 목표를 사용하여 hemocytometer에 정자를 계산합니다. 각 분석에서 필터를 통과 정자의 총 수를 계산하는 계산하고 희석 요소를 사용합니다.

3. Zigmond 챔버를 사용하여 개구리 정자 추적 분석

1. 찍고에 대한 거꾸로 현미경 워크 스테이션을 준비합니다. 우리는 소니 DXC - 390 3 칩 색상 아날로그 비디오 카메라 또는 하마 마츠 오카 - 03G 흑백 디지털 카메라 중 하나를 갖춘 니콘 Elipse TE300 거꾸로 현미경을 사용합니다. Zigmond 챔버 슬라이드는 22x40 mm 커버 유리를 수용하기 위해 무대 판에서 충분한 개방와 사이드 다운 무대에서 휴식을해야합니다. 이 배치는 개구리 정자가 중력에 대한 수영 수있다는 사실에 의해 necessitated 있습니다. 둘 사이 실행 전망대 플랫폼 중 4X 또는 10X 목적 렌즈 초점골짜기.
2. 카메라가 초점과 전망대를 중심으로되어 있는지 확인하기 위해 테스트합니다. 소니 카메라를 사용하는 경우, 출력은 비디오 모니터와 비디오 신호에서 초당 7 프레임을 디지타이징 수 A / D 컨버터 (프레임 그래버)로 전송됩니다. 디지털 스트림은 RAM의 4 GB 이상의 선호 3 GHz의 이상에서 실행하는 컴퓨터를 사용하는 처리됩니다. 우리가 귀공자 CG - 7 프레임 그래버를 조절 귀공자 이미지 소프트웨어 (NIH 이미지의 사용자 정의 Windows 버전)를 사용하지만, 이러한 제품은 더 이상 사용할 수 없습니다. 현재 솔루션은 아날로그 비디오 카메라 캡쳐 VirtualDub 플러그인과 함께 이미지 J 소프트웨어를 사용하는 것입니다. 하마 마츠 카메라를 사용하는 경우, 디지털 출력은 올림푸스 cellSens 소프트웨어 처리 및 컴퓨터 모니터에 표시됩니다. 두 경우 모두, 데이터는 8 비트 티파니, 스택 등 중 내부 또는 외부 하드 드라이브에 저장됩니다. 귀공자 이미지 소프트웨어를 사용하면 이미지 J.를 사용하여 스택에 TIFF 이미지 시퀀스의 전환이 필요합니다
3. 을 현미경 분야는 대부분 또는 모두 전망대 플랫폼 너비를 포함해야합니다. 최상의 결과에 대한 위상 대비 혹은 어두운 필드 광학을 사용합니다. 차동 각 표면에 초점을 맞춤으로써 결정으로 전망대 표면과 커버 유리의 아래쪽 사이의 거리 15 ~ 20 μm의해야합니다.
4. F1 버퍼에 적절한 농도에서 chemoattractant를 준비합니다. 앞에서 설명한 것처럼 Xenopus laevis의 정자 준비 및 사용 전까지 얼음 1.5 X OR2 버퍼에 저장합니다.
5. Zigmond 챔버를 조립. 마른 깨끗한 챔버로 시작합니다. 5 mm 및 병렬 각 트로프의 바깥쪽 가장자리에 대한 micropipette 장소에게 실리콘 오일 (4 μl)의 라인을 사용합니다. 실리콘 기름이 골고루 각 트로프의 바깥쪽 가장자리로 확산 수 있도록 챔버에 22x40 mm 커버 유리를 놓습니다. 예비 실험 그 정자 고집이 문제를 보여주면 Fabro 외 의해 제안으로, 하나는 nitrocellulose와 코트 덮개 유리를 할 수 있습니다. ^3. Alternatively (예 : 1퍼센트 BSA)에 사용되는 버퍼에있는 단백질의 포함은 또한 정자 고집을 줄일 수 있습니다.
6. 커버 유리가 무대와 접촉을하지 않는주의되는 현미경 단계에있는 원형 컷아웃를 통해 챔버와 장소를 반전. 이것은 거꾸로 구성은 플랫폼에 구유에서 Xenopus의 정자를 가지고하는 것이 필요합니다. 포유류의 정자와는 달리, Xenopus의 정자는 플랫폼에 도달하는 중력에 대항 수영 정도로 강력하지 않습니다.
7. 상온에서 F1 버퍼와 혼합 1시 10분하여 1.5 X OR2 버퍼에 Xenopus의 정자 20 μl을 활성화합니다. 절단 팁과 micropipette를 사용하여 즉시 구유에 운동성 활성화 정자의 70 μl를 전송합니다. 이것은 낮은 각도에서 micropipette를 개최하고 구유의 측면 오프닝에서 팁을 배치하여 이루어집니다. 배출 세포 현탁액은 모세관 작용에 의해 구유와 다리를 채웁니다. 다음 chemoatttractant 솔루션을 사용하여 같은 방식으로 반대 여물을 입력합니다.
8. 삼분 이내에 찍고 시작 (Xenopus의 정자 운동성 제한된 수명을 가지고) 및 5 분 계속합니다. 찍고의 끝에서 챔버를 해체하고 압력 물 흐름과 물총 병에서 에탄올과 계곡 및 전망대 플랫폼을 씻는다. 전망대 플랫폼과 골짜기를 오염되지 않도록주의하는 종이 잎사귀로 상부 표면에서 실리콘 기름을 제거합니다.
9. 필요한 경우, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 TIFF 이미지 시퀀스 또는 스택에 캡처한 비디오 데이터를 변환합니다. 그런 다음 이미지 J에서 처음으로 21 프레임 (3 초)에서 파일을 엽니다하면 추적 50 정자까지 선택할 수 있습니다. 바이어스를 피하기 위해, 관찰 필드의 모든 지역에서 그들의 궤적 데이터의 지식없이 정자를 선택했습니다. 포인트 각 정자 시간 (xyt 데이터 세트)의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포의 탄도를 캡처 및 이미지 J. 시각화의 탄도를위한 모듈 - 플러그인 MtrackJ를 사용하여 마우스를 클릭하고 궤도를 계산거리, 축 부품 및 MtrackJ 이내 판매율. 또는 xyt 데이터를 가져오는 이러한 작업을 더욱 수치 분석 (예 : 방향, chemotaxis 매개 변수와 매개 변수 histograms) 수행하면 Microsoft Excel에 설정합니다.
10. 선형, 곡선 및 원형 패턴뿐만 아니라 전환 같은 기능을 포함하여 운동의 전반적인 패턴을 감지하기 위해 Excel에서 각 정자에 대한 플롯의 탄도. 및 Y 축 및 그라데이션 축에 상대적으로 여행의 평균 각도와 같은 방향 매개 변수 - xyt 데이터를 활용하여 평균 곡선 속도, X 함께 그물 여행 (기울기)를 계산하기 위해 설정합니다.

4. 대표 결과 :

두 챔버 분석에서 중요한 기술 매개 변수는 크기와 챔버의 모양, 멤브레인의 다공성과 부화의 길이입니다. 정자의 큰 볼륨 (사전을 요구하는 등 정자를 가지고있는 상부 챔버의 크기는 직경에서 너무 크게하지 않아야ferably 0.5 ML 이하)가없고 상부 챔버 세포 현탁액의 높은 열 (<1cm)을 만들만큼 깊이해야합니다. 상부 챔버 삽입을 둘러싼 하부 챔버 버퍼의 볼륨은 정확히 않도록 artifactually 세포막을 통해 정자를 강요하는 transmembrane의 수압을 만들 수 없습니다 삽입에 세포 현탁액의 수준과 일치해야합니다. 로드하는 동안 세포막을 통해 갈 수 정자를 방지 초기 이상의 수압에서 정자로드 결과 다음 잘 먼저 하단에 빈 삽입의 위치. 멤브레인 기공 크기의 선택은 정자의 크기, 그리고 다공성 멤브레인 삽입의 상업 가용성에 따라 결정됩니다. 우리는 12 μm의 기공이 더 정확한 집계를 허용 정자의 높은 숫자의 통과를 위해 제공하지만, 개구리 정자와 assays이 중 8 또는 12 μm의 직경의 모공을 활용할 수있는 것을 발견했습니다. 12 μm의보다 큰 기공 크기는 상업적으로 사용할 수 있도록 표시되지 않습니다. TI를 사용하는 대신ssue 문화 삽입 96 - 웰 플레이트에 chemotaxis assays위한 Neuroprobe의 점막의 사용이다. 이것은 잠재적으로 더 큰 처리량 및 기공 직경의 넓은 범위를 제공합니다. 큰 포유류의 정자가 큰 구멍 직경을 필요로 보일 수있을 것입니다하지만, 우리는 성공적으로 12 μm의 모공 (버넷되지 않은 관찰)와 삽입을 사용하여 마우스 정자 chemotaxis를 assayed있다. 우리가 아직이 가능성을 테스트하지 않은 있지만, 대조적으로, 작은 기공 크기는 작은 정자 (예 : 성게)에 적합 수도 있습니다.

설명한 두 챔버 분석 중 하나 단점은 정자가 있으므로 배경 비율에 신호를 감소, 따라서 필연적으로 중력에 의해 일부 정자 통과의 결과 상단 챔버에 배치됩니다 것입니다. 이것은 Xenopus의 정자가 포유류의 정자가 있으므로 중력에 대한 수영을 자신의 운동성 충분한 활발한되지 않은 사실에 의해 necessitated 있습니다. Xenopus의 정자를 시금 또 다른 어려움은 사실이다 그들의 운동성의 리터ife 시간이 짧은 - 5~15분 활성화 후. 이 제한은 정자 여러 assays을 수행마다 2~3분을의 새로운 배치를 활성화하기 위해 필요하기위한 기준이됩니다. 결과적으로, 시간 코스 연구는 대부분의 정자 통로가 분석 ⁵ 처음 20 분 이내에 발생 보여주었다. 우리가 50 분 잠복기를 사용하지만,이 기간은 가능성이 20 ~ 30 분 누전 수 있습니다. 대조적으로, 몇 시간 동안 운동성이있는 정자가 남아있는 마우스에 대한, 우리는 좋은 결과를 (버넷되지 않은 관찰)과 검정의 2 시간 동안 최대 사용하고 있습니다.

개구리 정자를 사용하여 두 개의 챔버 분석에서, 다공성 멤브레인 통해 정자 통과의 총 개수는 일반적으로 10-20000 또는 상부 챔버 삽입에 배치 정자 2 ~ 약 1 %입니다. 하단 챔버의 chemoattractant 그라디언트의 존재는 4-10 배만큼 정자 통로를 높일 수 있습니다. 그림 2는이 분석을 수행할 일반적인 선량 반응 곡선을 보여줍니다. extrXenopus 계란 젤리 ( "계란 물") 알려진 chemoattractant 단백질 allurin (빨간 동그라미)를 포함 행위는 dilutions 일련의 하단 챔버에 배치되었다. 각 분석에 포함된 총 계란 물 단백질은 마이크로 그램 / 분석에 있습니다 - 원래 50 μl 볼륨에서 제공 금액을. 전달 단백질이 확산 기울기를 형성하기 때문에, 정자가 반응 단백질의 실제 농도 범위는 알려져 있지 않지만 전달 드롭의 단백질 농도보다 5-10 배 낮은 것으로 추산 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 도입 단백질의 양이 아니라 집중력을 나타냅니다. 보통 우리는 각각의 선량 및 평균 결과에 대한 중복 또는 세중의 assays를 수행, 우리는 다음 각 실험에서 다른 남성의 정자를 사용하여 전체 실험 3 또는 4 번 복제합니다. 평균의 의미 및 표준 오류의 표준 오류와 함​​께 각각의 선량 계산되는 일반적 의미의 5-10%되는 의미합니다. kno없이 단백질 참고소 혈청 알부민 등 (오픈 동아리, 그림. 2) wn의 chemoattractant 활동은 세포막을 통해 정자 통로의 낮은 수준이 아닌 구체적인 증​​가를 생산 수 있습니다. 상승 위상 및 감소 단계 - 흥미로운 관찰 계란 물에 대한 선량 반응 곡선이 multiphasic 때문입니다. multiphasic 관계 이런 종류의 정자 chemoattractants에 대한 일반적입니다, follicular 유체에 인간 정자의 반응은 계란의 주변에서 발견 chemoattractant의 높은 농도에서 유용하게 생각됩니다 더 검색 답변을 축소하기 위해 사용될 수 있습니다 유사한 biphasic 관계 ⁶ 보여줍니다 정자의 부분.

때때로 우리는 따라서 chemoattractant에 의해 만들어진 배 증가 감소,이 분석에 대한 제어 값이 정상보다 높은 것을 발견. 보통, 이것은 분석 기간 동안 필터 삽입의 기계적 방해 추적할 수 있습니다. 그러므로, 그것은 정자 또는 체를로드하는 동안 삽입을 방해하지 않는 것이 중요합니다moattractant는 분석 보육 중에하거나 삽입이 제거됩니다. 특히 중요한 삽입에있는 정자 저수지가 잘 밖으로 삽입을 운반하기 전에 micropipette 또는 흡입에 의해 제거된다는 점입니다. 이것은 삽입 제거로 아래쪽 챔버에 다공성 멤브레인 통해 전파되지 않습니다 정자 보장합니다.

Zigmond 챔버 분석에서 중요한 기술 매개 변수는 coverglass와 관찰 플랫폼 사이의 거리, 비디오 관찰의 확대, 사용되는 광학의 종류 및 프레임 속도를 포함합니다. 더 기름, 큰 거리 -이 거리를 커버 유리와 챔버 슬라이드 사이의 인터페이스에 사용되는 실리콘 오일의 양을하여 다양한 수 있지만 전망대 사이의 거리는 일반적으로 10-15 μm의 수 있습니다. 유체의 얇은 비행기 양식에 그라디언트뿐만 아니라 한 번 형성 그라디언트의 장수에 필요한 시간의 양을 증가시킵니다. 유체의 두꺼운 비행기보다 빠른 g 수 있습니다radient 형성하지만 그라데이션이 짧은 수명과 적은 안정성이 있습니다. 기울기 형성의 역학 관계가 잘 chemoattractant에 형광 염료 또는 형광 dextran을 사용하고있는 역학을 볼 수 형광 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 테스트 시약은 사용중인 chemoattractant과 역학이 정자의 운동의 기울기 형성 및 녹화에 대한 허용해야 몇 분 판단하는 데 결정으로 분자량에 일치해야합니다.

전체 전망대 플랫폼은 우리가 설명되어있는 분석 조건에서 같은 시각이있다면 사용되는 배율이 낮은 전체 (4X 또는 10X 목적)하여야한다. 한 flagellar 동작을 해결하기 위해 비교적 짧은 궤적 세그먼트 또는 소원을 모니터링하고자하는 경우 반면에, 높은 배율은 (40x 63x 또는 객관적) 유용할 수 있습니다. 본 논문 또는 자동 추적에 의해 설명된대로 더 SOP의 연습으로 추적이 세미 수동 방법을 통해 진행 될 수 있습니다이러한 MetaMorph 또는 Imaris 트랙으로 histicated 소프트웨어 패키지. 각각의 경우에, 추적의 용이성은 운영자에 의해 또는 소프트웨어를 이용한 개체 인식에 의한 것인 지의 이미지 대비에 매우 의존한다. 명시야 광학 어떤 경우에 사용될 수 있지만, 위상 콘트라스트 광학의 사용 또는 darkfield 광학는 일반적으로 필요합니다. 마지막으로, 프레임 속도는 추적 원하는 시간 해상도에 따라 달라집니다. 초당 4-8 프레임 - - 세미 - 수동 방법을 우리가 절차에서와 같이 사용할 경우, 하나는 아마도 상대적으로 낮은 프레임 속도로 제한됩니다 녹음 데이터의 노동 집약적인 특성으로 인해. 한편, 영상 속도 관찰 그러한 flagellar 웨이브 형태로 신속한 답변을 위해 필요할 수 있습니다. 자주, 실험의 목표는 최고의 사람이 또한 확대, 광학, 또는 디지털 이미지 처리와 같은 다른 매개 변수를 변경하고자 이후 별도의 느린 프레임 속도 실험 및 빠른 프레임 속도 실험을 수행하여 제공하고 있습니다.

Zigm에 대한 일반적인 결과ond 챔버 추적 분석은 영화 1의 비디오 클립 간 57 개구리 정자에 대한 본 그 같은 궤도의 집합으로 구성되어 있습니다. 전망대 플랫폼의 이미지에 대해, 개인 정자의 궤도는 제어 실험 (NO chemoattractant 기울기 현재)를 위해 빨간색으로 추적할 수 있습니다. 각 정자 시간의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포의 탄도는 역모와 MtrackJ으로 로그온하고 Microsoft Excel로 가져올 수 있습니다. 탄도 분석을 위해, 우리는 원래 Fabro 외 개발한 협약과 일치, X - 축과 직교 축으로 Y 축으로 chemoattractant 그라데이션 축을 지정합니다. ^3. 그림 3 그림, 촬영한 실제 궤도는 단계로 구성되어 있습니다, 그의 길이 궤도 (파란색 / 금색 화살표)에 여행 곡선 거리를 동일의 합계. 각 정자에 의해 여행 NET 거리와 방향의 궤도의 처음이자 마지막 지점 (적색 대각선 화살표)를 연결하는 벡터이다.NET 여행은 자사의 X 축 구성 요소와 Y 축 구성 요소로 분리될 수있다 (빨간 점선 화살표, 또한 그물 델타 X 각각 그물 델타 Y, 칭했다).

척추 정자의 chemotaxis은 여행의 방향으로 비교적 미묘한 교대를 포함 할 수 있기 때문에, 정자의 큰 번호 (100-300)는, 무작위로 선택된, 대개 4-6 독립적인 실험에서 풀링된 데이터를 필요로하는 각 조건에 대해 분석하고 있습니다. 예시의 목적을 위해, 그러나, 우리는 쉰 개구리 정자에서 데이터를 사용합니다. 표 1은 정자 여행의 변화를 감지하는 데 사용되는 일반적인 매개 변수를 보여줍니다. chemoattractant의 존재에 전체적으로 정자 인구가 더 밀접하게 그라디언트로 정렬되는 탄도를 따라, 경우 X - 축을 따라 의미 네트 여행은 크게 증가합니다. 우리 예제에서, 의미 NET X 축 여행은 계란 물의 존재에 세 배 이상 증가했다. 하나는 또한 advan을 가지고있는 정자 인구 NET X 축 여행의 히스토그램 플롯 수 tage는 응답 정자의 작은 subpopulations 발견 될 수 있습니다. Fabro 외 ^3. 개발한 두 개의 매개 변수 또한 인구를 검색할 수 있습니다. 긍정 NET X 축 여행 (% ΔX는> 0)를 보여주는 정자의 비율 및 NET 선형 여행을 보여주는 정자의 비율이 모두 노 그라데이션 축 (% ΔX / | ΔY |> 1)에서 45도 이상의 극적으로 증가시킬 수있다면 정자의 subpopulations를 구분하는 경우 전체 정자 인구 chemoattractant 또는 작은했지만 여전히 상당한 액수에 의해 구분합니다. 표 1에있는 우리 예제 계란 물 기울기에 노출 오십 개구리 정자에 대한 두 매개 변수의 증가를 보여줍니다. 무작위가 아닌 지향 움직임이 50 % 이러한 매개 변수 모두 25 % 각각 아닌 제로 가치를 제공됩니다,이 (예 : 표 1에서 것과 같이)보다 높은 제어 값은 낮은 샘플 번호 또는 하나 때문에 배경을 나타냅니다 실험 디자인에 특히 정자 방향으로 편견 수 있습니다.

내용은 "chemoattractant 에이전트에 대한 응답으로 정자의 여행> 방향은 바로 세타, 각 정자와 그라디언트 (X) 축 NET을 여행의 벡터 사이의 각도에 의해 평가하실 수 있습니다. 말은 세타이 감소되는 표 1에 표시 예제 인구로 정자의 탄도가 더 그라디언트에 부합했음을 나타냅니다. NET X 축 여행 (위 참조)와 마찬가지로 계란 물 기울기에 정자 수영장, 정자 인구 쎄타는 접근법은 또한 민감한, 배포 표현할 수 반응 정자 최근 Gakamsky 외 ⁷ 공부했습니다 하나 subpopulations 수 있습니다.

마지막으로, 개별 정자에 대한 곡선과 즉각적인 판매율도 시간의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포의 탄도를 설명하는 데이터에서 추출하실 수 있습니다. 하나는 따라서 chemokinetic 반응뿐만 아니라 제안, 속도의 증가뿐만 아니라 여행의 방향에 변화가있다는 것을 찾을 수chemotactic 응답.

이러한 데이터는 정자의 탄도 분석을위한 출발점을 나타냅니다. 또한 분석 Bohmer 외 실시로 순간별로 한 순간에 탄도 선형성 및 곡률 측정을 포함할 수 있습니다. ⁸ 시바 외. ⁹ 버넷 외 실시로 보니의 자동 감지. ^10, 비선 형성 등 프랙탈 분석을 ^11,12으로 gauged. 이러한 탄도를 헤엄치는 정자가 높은 배율에서 모니터링되어있는 하나의 이미지도 flagellar 동작과 같은 여러 실험실 ^{8,9,13,14,15,16에} 의해 수행 실시간 칼슘 신호 수 있습니다. 이러한 연구는 무척추 동물과 포유류의 정자가 모두 chemoattractant 소스 방향으로 그라데이션까지 정자의 날카로운 교대로 chemoattractants에 응답할 것을 증명하고있다. 이러한 전환은 많은 지도자로서 정자 방향을 변경 flagellar 숨어 함께 제공됩니다 것이, 정의, 파 리로 시작한 것처럼 숨어편모를 통해 전파 KE 칼슘 신호. 따라서 정자 추적의 궁극적인 목표는 chemotactic 기울기에 정자 방향의 기초 역할을 flagellar 추진의 변화와 함께 시스템 역학을 신호 상호 연관시킬 수 있습니다. 이러한 목표는 나선형 운동 ¹⁷ 여행 Xenopus의 정자에 도달할 수 아직 그들의 궤도 ¹⁰ 낮은 곡률을 전시하고, 그의 칼슘 신호는 모니터로 아직있다.

우리는 두 개의 챔버 정자 축적 분석 및 특정 수정이 이루어질 경우에는 Zigmond 챔버 추적 분석이 포유류의 정자를 위해 사용할 수있는 모두를 우리는 Xenopus laevis의 정자를 위해 사용하는 분석 방법을 자세히 설명에 여기에 초점을 맞추고 있지만. 두 assays는 Zigmond 챔버 분석, 현미경 단계 따뜻해에서 따뜻한 슬라이드를 사용하여 원하는 ° C하면 37 실시하고 있습니다. 일반적으로 포유류의 정자는 격리 capacitated 및 적절한 포유류의 버퍼를 사용하여 incubated 것입니다D의 chemoattractants하지만, 데이터 분석 수륙 양용 종 여기 설명된 것과 유사한 것입니다. 하나 더 차이가 포유류의 정자 이후 Xenopus의 정자와는 달리, 전망대에까지 수영을 할 수 Zigmond 챔버은 보통 수직으로 현미경의 무대에 수직으로 배치된다는 점입니다. 아직 안된 마찬가지로,이 두 assays는 향후 업무에 종 수의 정자에 응용 프로그램을 볼 수 있습니다.

그림 1. 두 챔버 분석의 도식 다이어그램. 정자은 12 μm의의 모공과 폴리 카보 네이트 필터입니다 하단에있는 삽입에 배치됩니다. chemoattractant 솔루션은 신중하게 농도 기울기 형성을 시작하기 위해 우물에 pipetted 있습니다.

두 챔버 정자 chemotaxi를 사용하여 개구리 정자에 대한 그림 2. 대표 데이터의 분석. 계란 물 엑스의 준비 laevis 달걀은 정자 chemoattractants의 특징입니다 다상 복용 - 활동 곡선을 전시하고 있습니다. 약간 소 혈청 알부민 증가 정자 통로 - 단백질의 특이 현상이 효과. 그림은 알 - Anzi & 챈들러 ⁵ 수정되었습니다.

영화는 1. 개구리 정자의 탄도를 보여주는 비디오 클립 Zigmond 실의 전망대에 빨간색으로 꾸몄다. 플랫폼의 너비는 1mm입니다. 비디오 클립을 볼하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 축 대회, 넷 선형 여행을위한 정자 곡선 궤도와 벡터가 Zigmond 챔버 관측 플랫폼에 꾸몄다 있습니다. 얻은 데이터는 세 가지 유형의 수 있습니다. 첫째, 정자의 탄도 자체 (청색 / 금색 화살표)는 특정 패턴 님을 확인할 수 있습니다서클 전환 (별표)로 채널. 곡선 거리와 곡선 판매율은 탄도 경로 측정할 수 있습니다. 둘째, 네트워크 직선 거리 전체 궤도, 여행의 그물 X (기울기) 축 구성 요소를 통해 여행, 여행의 그물 Y 축 성분과 X 축 및 NET 여행의 벡터 사이의 각도 세타는 각 궤도 계산 수 있습니다 및 추적 모두 정자를 통해 배포 비교했다. 개별 궤도 내에서 세그먼트 여행의 속도와 방향으로 셋째, 즉각적인 변경 사항은 개별적으로 또는 인구로 공부하실 수 있습니다. 위, 챔버의 사이드 뷰가 다이어그램에 표시됩니다.

표 1. 매개 변수 자주 Zigmond 챔버에서 데이터를 분석에 사용.

토론

amoeboid 운동이나 flagella 구동 수영에 의해 움직이는 세포의 Chemotaxis은 많은 생물 학적 문맥에서 발견하고이 현상의 연구는 실용적이고 안정적​​인 assays의 가용성을해야합니다. 이러한 성게 계란이나 fruiting기구를 형성 점액 금형 세포의 모임에 정자의 매력으로 현상의 몇 가지 예입니다, 즉각적인 시각적 영향을 미칠. 이러한 현상의 Quantitation는 Eisenbach ^18에서 설명한대로 다양한 방법으...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
항목의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24 잘 접시	Becton - Dickenson	1,147분의 35
12 μm의 기공 멤브레인와 12mm 외경 삽입	Millipore	PIXP01250	우리는 이전에 Costar - 코닝 transwell 플레이트 # 3403 - 지금은 중단하는데
Zigmond 챔버	Neuroprobe	Z02
실리콘 오일	제너럴 일렉트릭	SF1154	다우 코닝 550의 유체에 해당
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