ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

요약

이 프로토콜은 자신의 주변의 세포외 기질에서 발표가 되려면 여러 phenotypes로 차별화에 시달릴 수도 줄기 세포의 고유 기능을 활용에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 원고는 동시에 지방 파생 줄기 세포를 공동으로 차별화하는 데, PEG-섬유소와 콜라겐으로 구성되어 bilayered 히드로겔을 활용 모델, 우리의 설명 및 특성을 확장 ¹.

초록

년간 천연 고분자로 인해 자신의 호스트 biocompatibility 및 시험 관내 및 생체내의 세포와 상호 작용하는 능력의 중요성을 얻고있다. 재생 의료의 가능성을 가지고 연구의 영역이 소설 biomaterials 및 줄기 세포의 조합을 사용합니다. 조직 공학 분야의 기본적인 전략은 세포 기능을 감독을위한 입체 비계 (예 : 세포외 기질, hydrogels, 마이크로 / 나노 입자를 decellularized)의 사용이다. 이 기술은 세포, 그들은 고수 수있는시 기판이 필요 분아 따위에 의해 중식, 그들의 차별화된 세포 표현형 및 기능 ^2-3 표현하는 발견으로 변화시켰습니다. 최근에는, 그것은 또한 세포 부착에 대해 이러한 기판을 사용할뿐만 아니라 상호 작용 및 매트릭스 기판 (예 : 세포외 기질, ECM) ^4에서 단서를뿐만 아니라 결정되었습니다. 따라서 세포 공사장 공중 발판은 상호 연결조직 개발, 조직, 그리고 궁극적인 기능을 제어하는​​ 역할을합니다. 지방 파생 줄기 세포 (ASCs)가 mesenchymal가 아닌 hematopoetic 줄기 세포 멀티 혈통 차별을 전시하고 세포 즉시 사용할 소스 (예 : 사전 혈관 endothelia 및 pericytes)으로 사용할 수있는 지방 조직에 존재한다. 우리의 가설은 지방 파생 줄기 세포가 bilayered 매트릭스 ^1에 간단히 공동 culturing 그들에 의해 동시에 phenotypes 서로 다른 방향으로 이동 수있다는 것입니다. 저희 실험실은 피부 상처 치유에 초점을 맞추었습니다. 이를 위해, 우리는 피부에 특정한 상처 치유 ECM 환경의 특성과 기능을 모방 수있는 하나의 복합 천연 biomaterials의 행렬, 섬유소, 콜라겐과 키토산을 만들었습니다.

프로토콜

1. 지방 파생 줄기 세포 (ASCs) ^{1, 5를} 분리해

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

1. 쥐 perirenal 및 epididymal 지방 격리하고 앞에서 설명한 ^5로 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 무균 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)으로 씻는다. 이 연구는 동물 복지 법, 구현 동물 복지 규정 및 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 원칙에 따라 준수 실시되었습니다.
2. 조직을 말하다하고 실온에서 8 분 500g에서 50 ML 튜브 및 원심 분리기로 1퍼센트 FBS가 포함된 HBSS의 25 ML에 1-2g을 전송.
3. 자유 부동 지방 조직 계층과 125-ML Erlenmeyer 플라스크에 송금을 모아서 37시 45 분 대한 HBSS에서 collagenase 2 형 (200 U / ML)의 25 ML ° 궤도 흔드는 (125 RPM)에서 C로 취급합니다.
4. 조심스럽게 pipeting에 의해 액체 분획을 (오일과 지방 레이어 아래)을 제거하고 100를 통해 순차적으로 그것을 필터링 - μm의 70 - μm의 나일론 메쉬 필터. 상온에서 10 분 동안 500g에 여과물을 원심 분리기, 뜨는을 대기음, 그리고 HBSS의 25 ML로 두 번 펠릿 씻는다.
5. MesenPRO RS 형성제 (페니실린 G의 100 U / ML, 100 μg / 스트렙토 마이신 황산의 ML과 amphotericin의 0.25 μg / ML 항생제 - antimycotic으로 보충 성장 매체 (MesenPRO RS 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간)의 50 ML에 세포 펠렛을 Resuspend 이 T75 flasks (25 ML / 플라스크)에 L-글루타민 및 피펫 전지의 B), 그리고 2 음.
6. 문화 37 5 % CO _2-humidified 인큐베이터에서 ASC ° C (통로 2-4 ASCs가 모든 실험에 사용됩니다.)

2. 키토산 Microspheres (CSMs)를 준비

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

1. CSMs은 우리의 이전 프로토콜 ^5를 사용하여 이온 coacervation 기법과 함께 워터 인 오일 유화 과정에서 준비가되어 있습니다. 콩 기름, N-octanol (1시 2분 V / V)과 5으로 구성된 오일 위상 혼합물의 100 ML에 키토산의 수용액 (초산 0.5 M의 3% W / V 키토산 6 ML)를 유상으로 만들다 % 솔비 탄 모노-oleate (폭 80) 유화제, 반대 방향으로 동시에 오버헤드 (1700 RPM) 및 자기 저어 (1000 RPM)를 사용. 가교가 발생하기 전에 조기에 형성 micelles이 용액에 남아있을 수 있고 바닥에 정착하지 않는 혼합 보장이 이중 방식입니다. 또한,의 자석 볶음 바 AIDS 마이셀 형성 및 rigidization 동안 키토산을 취소 수렴.
2. 혼합물은 지속적으로 안정적인 물 인 석유 유제를 얻을 때까지 약 1 시간 동안 흔들 저어. 4 H (24 ML 합계)에 대한 N-octanol 매 15 분 안에 1퍼센트 W / V 수산화 칼륨 1.5 ML의 추가와 연관된 이온 십자가를 개시
3. 는 교차 연결 반응 혼합물이 포함된 CSM의 느리게 가만히 따르다 석유 단계 수료 후 즉시 아세톤의 100 ML을 추가, 솔루션은 기름 성분으로 인해 구름이 될 것입니다. 오분 후, 가만히 따르다가, 아세톤의 추가 100 ML을 추가하고 실온에서 하룻밤 알을 품다. 다음날 5 분 동안 아세톤으로 구슬을 다시 씻는다. 공연 후에는 이러한 일련 모든 기름을 제거하고 아세톤 솔루션은 명확 때까지 세척을 계속하지 않을 경우 해결책은 명확​​ 살이어야 씻는다.
4. 진공 건조기에서 복구된 분야를 건조하고 추가 처리없이 분석합니다. 당신은 평균 CSM 입자 크기, 밀리그램 당 표면적 및 입자 크기 분석기를 사용하여 단위 입방 볼륨을 확인할 수 있습니다.
5. 후속 실험의 경우 잔류 염분을 제거하고 절대적인 에탄올의 5 ML과 하룻밤 세척하여 멸균을 위해 멸균 물을 CSM 세 번 씻는다.

3. 결정CSMs에서의 자유 아미노 그룹의 개수

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

1. trinitro benzenesulfonic (TNBS) Bubnis 및 Ofner ⁶ 산성 분석을 사용하여 연결하는 이온 간 후 CSMs에있는 무료 아미노 그룹의 개수를 결정합니다. 40 ° C 4 H를위한 50 ML 유리관의 0.5 % TNBS 용액 1 ML과 microspheres의 5 밀리그램을 품어 60시 6N HCL 3 ML의 추가 ° 2 시인데을위한 C와 hydrolyze.
2. 실내 온도에 샘플을 시원하고 탈이온수 5 ML과 에틸 에테르 10 ML을 추가하여 무료 TNBS 압축을 풉니다.
3. ° C 물 목욕 15 분 실온에 시원한 잔여 마취제, 증발 및 물 15 ML로 희석하기 위해 40 수성 단계의 5 ML 나누어지는을 따뜻하게.
4. 빈과 키토산은 CSM P 사용으로 키토산없이 TNBS 솔루션을 사용하여 분광 광도계로 345 nm의 흡광도에서 측정아미노 그룹의 총 수를 결정하는 배상. 키토산에 상대적인 CSM 무료 아미노 그룹의 수를 예상됩니다.

4. CSM의 로딩 ASC

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1. 하룻밤 무균 HBSS의 섹션 2.5에서 소독 CSMs의 5 밀리그램을 평형과 8에 추가 - μm의 기공 크기의 멤브레인 문화 플레이트 인서트 (24 잘 플레이트).
2. CSMs가 막에 정착한 후, 조심스럽게 HBSS를 대기음와 인서트의 외부로 성장 미디어 삽입 700 μL의 내부에 성장 배지 300 μL를 추가합니다.
3. 문화 플레이트 인서트 내부 CSM 이상 성장 매체와 종자 200 μL의 적절한 농도에서 Resuspend ASCs (1 × ^10월 4일부터 4일까지 × 10 ^4). 문화 삽입 내에서 매체의 최종 부피는 시딩 후, 500 μL입니다.
4. Incub37 5 % CO ₂ humidified 배양기에서 24 H에 대한 CSMs에 ASC 씨앗을 품고 ° C를 먹은

5. CSMs에 ASC로드 및 세포 생존 능력의 비율을 결정

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

1. 삽입 막으로 마이그레이션한 세포를 방해하지 않고 멸균 1.5 ML microcentrifuge 튜브의 인큐베이션, pipet ASC-로드된 CSM 후에.
2. 잔여 매체를 제거하고 튜브에 신선한 성장 매체 250 μL를 추가합니다.
3. 각각의 튜브로 MTT의 25 μL 추가 [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium 브로마이드] 솔루션 (5 밀리그램 / ML)과 ₂ humidified 5 % CO에서 4 H 위해 품어 37 보육 ° C.
4. 부화 후, 매체를 제거 디메틸 sulfoxide 250 μL를 추가하고 formazan 복잡한 solubilize 위해 2-5 분 와동 혼합.
5. 2,700g에서 CSM을 원심 분리기5 분, 뜨는 오프 pipet과 MTT 제조 업체의 사양에 따라 표준 플레이트 판독기를 사용하여 570 nm의 및 630 nm의 파장에서 그 흡광도를 결정한다.
6. 표준 곡선을 개발 배양해 정의 ASC 번호에서 얻은 값에 상대적 CSMs와 연관된 휴대폰 번호를 확인합니다.

6. ASC-CSM의 준비 및 특성화는 PEG-섬유소의 젤에서 임베디드

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1. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 섬유소 (PEG-섬유소) 히드로겔는 Suggs 외 준비한 ⁷ succinimidyl glutarate 수정된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 3400 다)를 분해하여. 트리스 버퍼 염분 (TBS, 산도 7.8) 및 필터 소독 4 ML을 사용하여 방금 실험을 시작하기 전에 0.22-μm의 필터. 용해 PEG가 처음 3-4시간이 응용 프로그램에서만 유효합니다.
2. 믹스 500 &무, 피브리노겐 재고 없음 L (TBS, pH는 7.8에서 40 밀리그램 / ML)와 37도 5 % CO ₂ humidified 인큐베이터에 20 분 6 잘 판과 부화의 문화 PEG 주식의 250μl ° C. 피브리노겐 :이 혼합물은 1시 10분, sg-PEG-SG의 어금니 농도 비율을 구성합니다.
3. CSM 5 밀리그램의 농도에서 ASC-CSM 250 μl을 가지고, (≈ 2 × 10 ⁴ 세포)와 PEGylated 피브리노겐 용액과 섞는다.
4. 즉시 트롬빈 주식 (25U/mL) 1 ML을 추가하고 신속하게 피펫으로 한 두 번 씹다. 10 분 완성 겔화 수 있도록하기 위해 37 ° C에서 PEG-피브리노겐과 트롬빈을 혼합 후에는 즉시 12 잘 판에 셀 - 젤 혼합물을 넣고 5 % CO ₂ humidified 인큐베이터에 incubated. 겔화 시간이 빨리이기 때문에, 이상의 5 초 동안 피펫 팁 내에서 겔 용액을 시도하고 지켜 볼수는 없다. PEGylated 섬유소는 트롬빈에 의해 죽습하고 PEGylated 섬유소의 히드로겔를 형성하고 있습니다. 등의, 일전자 최종 겔 제품은 PEG-섬유소로 언급됩니다.
5. HBSS로 두 번 PEG-섬유소의 젤을 씻어 37에서 5 % CO ₂ humidified 배양기에서 10 % FBS와 보충 알파 최소한의 필수적인 매체 (α-MEM) ° C.로 품어
6. 표준 광 현미경 기술을 이용하여 11 일 동안 젤로 CSM에서 세포의 마이 그 레이션을 관찰.

7. ASC-CSM의 준비 및 특성화는 콜라겐 젤에 임베디드

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

1. 2N NaOH를 사용하여 6.8로 산도를 조정 후 Bornstein ⁸ fibrillate의 방법에 따라 쥐의 꼬리 힘줄에서 추출한 제 1 형 콜라겐 (7.5 밀리그램 / ML)의 혼합 비율은 ASC-CSM (5 MG는 ≈ 2 × 10 ⁴ 세포를 포함).
2. 12 잘 판에 fibrillated 콜라겐-ASC-CSM 혼합물을 추가하고 5 %의 CO ₂ humidi에서 30 분 동안 품어37 들이었다 인큐베이터 ° C.
3. 전체 세동 후, 37 ° C.에 최대 5 % CO ₂ 배양기 humidified 11 일 동안 콜라겐-ASC-CSM의 젤을 품어
4. 표준 현미경 기술을 이용하여 11 일 동안 젤로 CSM에서 세포의 마이 그 레이션을 관찰.

8. Bilayered PEG-섬유소 - (ASC-CSM) - 콜라겐 젤 구조의 개발

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

1. 이중층 구조로 개발하려면 약간의 수정으로 위의 설명 콜라겐과 PEG-섬유소의 젤을 모두 준비합니다. 1)로드 ASC : 간단히, 4 단계 프로세스를 사용하여 콜라겐과 PEG-섬유소의 공사장 공중 발판 사이에 '샌드위치'ASC-CSMs 두 bioscaffolds를 사용하여 줄기 세포의 단일 소스의 철새와 공동 유도 속성을 공부할 수 있도록 CSM, 2)에 열 위에 fibrillated 콜라겐 겔과 계층 ASC-CSM 비즈를 던지다lagen 겔, 3) 캐스트 PEG-섬유소의 ASC-CSM-콜라겐 겔 이상 겔과 젤은 응고 수 있도록하고, 4) 잘으로 매체 추가하고 체외에서 세포를 공부하거나 (그림 1 참조 생체내 응용 프로그램에 대한 삽입에서 제거 삽입 ).
2. 1-ML 타입 혼합물에 ASC-CSM을 추가하지 않고, 7.1에서 위에서 설명한대로 한 콜라겐 (7.5 밀리그램 / ML) 혼합물을 준비합니다. 6 잘 조직 문화 삽입 (8 μm의 기공 크기)에 혼합 배치하고 37 ° C.에 5 % CO ₂ humidified 배양기에서 30 분 동안 품어
3. 문화 미디어 (200 μl)에 정지 ASC-CSM의 콜라겐 표면에 5 밀리그램 (10, 000 세포 / MG)를 완벽하게 세동, 레이어 후에. microspheres가 젤 위에 정착 후, 혼합물에 ASC-CSM을 추가하고, ASC-CSM-콜라겐 층 이상의 층 PEGylated 피브리노겐 / 트롬빈 솔루션을하지 않고, 같은 섹션 6.0에서 설명한 PEG-섬유소 젤을 준비합니다. PEG-섬유소 젤을 비교할 때, T 대신에 세포 배양 배지 250 μl를 사용세포를 포함하는 매체의 그는 250 μl.
4. 마치고, 배지와 구조를주고 전에 완전한 겔화을 달성하기 위해 5 %의 CO ₂ humidified 배양기에서 30 분 구조를 품어.
5. 전체 겔화 후, 하단 챔버의 구조와 매체 3 ML 이상의 상부 챔버의 매체의 장소 1 ML.

9. 증권 솔루션 만들기

주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다.

• 염화칼슘 주식 (40 음) :로만 CaCl ₂ 0.2 H ₂ O를 사용하여 탈이온수 100 ML와 CaCl ₂ 0.2 H ₂ O의 588.4 MG를 해산. 0.22-μm의 필터를 사용하여 소독.
• 폴리에틸렌 글리콜 : PEG가 산소와 반응성이 매우 높은하며 실내 공기에 노출되면 산화 될 수 있습니다. 따라서 PEG는 질소 (N ₂₎ 분위기 아래에 저장해야합니다. ACCurately 사용할 준비까지 -80에서 2-ML 원심 튜브 (사용하기 전에 N _2와 함께 튜브를 정화해야합니다) 및 매장 ° C에서 32 밀리그램의 무게를. 사용하기 전에 TBS 솔루션 4 ML에 PEG 32 MG를 해산.
  다음과 같은 솔루션은 모든 실험을하기 전에 신선한하셔야합니다.
  
• TBS 용액 : (25시 산도 7.75-7.77 ° C, 25 ° C에서 산도가 매우 중요합니다.) TBS 용액의 15 ML를 준비하려면, 조심스럽게 필터 소독 탈이온수 한 버퍼 정제를 해산하고 필요한 산도를 조정합니다. 그것이 매번 신선한 솔루션 대비 주식을 보관하지 마십시오.
• 피브리노겐 솔루션 : (40 밀리그램 / ML). 피브리노겐 농도 40 밀리그램 / ML를 만들기 위해 TBS에서 피브리노겐 가루를 해산. 4에서 자기 활동가를 사용하여 하룻밤을 용해 ° C. 그것은 TBS의 필요한 금액 전체 1-g 수량을 용해하는 것이 더 쉽습니다. 다음 날, 4 ° C (보통 흐림)에서 섬유소를 제거하고 그것을 허용동질적인 솔루션을 얻을 때까지 물 목욕 따뜻합니다. 마지막으로, 0.45-μm의 필터를 사용 피브리노겐 멸균을 필터링합니다.
• 트롬빈 용액 (25 단위 / ml) 쇼핑 : 트롬빈 솔루션을 만들기 위해 필요한 금액을 무게와 준비된 40 MM CaCl ₂ 0.2 H ₂ O에 함께 녹아 항상 재고를 만들기 위해 트롬빈의 전체 유리병을 사용하는 것이 좋습니다. 예 : -20 ° C. 200 CaCl _2의 MM 0.2 H ₂ O, 나누어지는 및 매장 : 5 개 구 트롬빈의 병을 디졸브

10. 대표 결과

여기에 제시된 기법의 전반적인 목표는 배달 차량으로 CSM을 사용하여 여러 phenotypes로 ASC의 동시 행렬 기반의 분화의 가능성을 입증하는 것입니다. 우리는 bilayered 콜라겐-PEG-섬유소 발판으로 CSMs에서 줄기 세포를 전달에서 체외 전략을 보여줍니다. ASC의 특성이 발판 reveale 내에 내장ASC-로드된의 CSMs는 콜라겐 및 PEG-섬유소의 레이어 사이에 "끼워 넣었지"할 수있는 D는 동시에 differentially 새로운 조건 하에서 번창하고 두 세포외 환경으로부터 신호를 받아. 우리가 먼저 세포 생존 능력과 철새 용량을 유지하기위한 모델 시스템의 기능을 특성화. 콜라겐은 그들의 "stemness"등 Stro-1 자신의 표현과 fibroblast와 같은 형태 (그림 2D 및 2 층)에 의해 입증되었습니다 유지를 위해 ASCs의 능력을 지원합니다. 그들의 튜브와 같은 구조 형태, 폰 Willebrand 인자 (그림 2E와 2G) 자신의 내피 세포 특정 표현, 그리고 pericyte 특정 표현에 의해 입증되는대로 반면, PEG-섬유소는 혈관 표현형쪽으로 차별 ASCs을 유도 NG2와 혈소판 - 유도 성장 인자 수용체 베타 (PDGFRβ) (데이터가 표시되지 않음). 또한, 이러한 관찰된 phenotypes 일찍 문화가 발생하는 것으로 나타났다, 11 일 동안 유지되었다로서 민주 공화국이다그림 3과 onstrated.

표 및 그림

이중층의 장점은 건설하세요 :

• 세포가없는 비계 혼자서 bioactive 발판으로 수행할 수 있습니다.
• PEG-섬유소는 성장 요인의 추가하지 않고 차별화하는 데 줄기 세포를 유도하실 수 있습니다.
• 콜라겐은 ASCs의 줄기 세포 표현형을 유지하는 데 도움하실 수 있습니다.
• 이중층의 구조는 다른 세포 유형의 마이 그 레이션하고 (예, 내피 세포, fibroblast, keratinocytes, 평활근 세포, pericytes) 분아 따위에 의해 번식하는 적극적인 기판으로 사용할 수 있습니다.
• 그것은 열심히하고 부드러운 조직을 재생하는 hydroxyaptite 또는 demineralized 뼈 같은 하드 조직 공학 공사장 공중 발판으로 사용할 수 있습니다.
• 이것은 다층 다양한 조직 - 공학 구조를 (등 피부 - 혈관, 혈관 - 상피, 피부 - 혈관 - hypodermal 등) 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
• 그것은 동시에 개발하는 단일 셀 소스를 사용합니다다세포 구획.
• 그것은 자연의 원산지이기 때문에 호스트 조직으로 통합하는 잠재력을 가지고 있습니다.
• 겔 구조 내에서 CSM은에서 마이 그 레이션하는 세포를위한 플랫폼을 제공합니다.
• CSM을 준비하는 데 사용되는 키토산은, 잘 알려진 활성 화학 유인 물질이다.
• "매트릭스 기반의 줄기 세포 분화"의이 프로토콜에 적용된 전반적인 컨셉은 다른 줄기 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 그러나 추가 조사는 매트릭스 구동 분화의 가능성을 결정하기 위해 보증합니다. bilayered 젤 비계는 지속하고 통제된 방법으로 세포를 전달하는 저수지 역할을 할 수 있습니다.
• 재건축 후, 젤은 여전히​​ 개별 구성 요소로 분리될 수있다.

그림 1. 도식은 전반적인 목표와 기법의 과정을 묘사. 1) 지방 파생 줄기 세포 (ASCs)은 싸다입니다키토산 microspheres에 aded. 2) 콜라겐은 다음 6 잘 삽입, 콜라겐 fibrillate하도록 조정 산도, 그리고 6 잘 플레이트 챔버에 배치 삽입에 부어있다. ASC-로드의 CSM의 분야는 다음 콜라겐을 통해 상상을 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. 3) PEGylated 피브리노겐 그러면 콜라겐 (ASC-CSM) 위에 부어 및 트롬빈의 추가에 의해 gelled합니다. 4) 최종 이중층의 구조는 다음 문화 삽입에서 제거하고 체외 또는 생체내 분석을 위해 사용될 수 있습니다.

ASC의 그림 2. 특성화는 콜라겐 및 PEG-섬유소 차원 매트릭스 내에 배양해. 격리된 ASC의) 위상 대조 현미경은 passaged과 일상 2 차원 세포 배양 기술을 사용하여 유지. Photomicrographs B, D 및 F는 ASC-CSM은 3 차원 콜라겐 겔 내에 배양해 묘사, C, E 및 G 쇼 ASC-CSM 하루에 1부터 3 차원 PEG-섬유소 겔 모두 내에 배양해 반면,2. B와 C)에서 ASCs는 두 비계 종류의 CSM의 영역에서 떨어져 이주 표시됩니다. ASCs는 줄기 세포 마커 Stro-1 (; 화살표 D) 그들의 표현을 유지하면서, 콜라겐 (B)에서 플랫, 스핀들과 같은 형태를 가지고있는 것 같습니다. PEG-섬유소의 ASCs에서 배양해 때하면 더 많은 튜브와 같은 구조를 전시하고 폰 Willebrand 계수 (E)과 같은 혈관 세포 마커를 표현하는 유도하고 있습니다. 전송 전자 현미경은 각 발판 이내 ASCs에서 보여준 전형적인 형태를 묘사. (; 화살표 G) 콜라겐 젤의 ASCs는 ASCs 일반적 lumenal (L 레이블) 구조를 형성하는 반면, 셀 (F)의 몸에서 연장 작은 filopodia (FL)가 보인다.

그림 3. 콜라겐의 bilayers 및 PEG-섬유소의 젤 사이 ASC-CSMs의 형태학의 분석. ASC-CSMs는 콜라겐 및 PEG-섬유소의 젤 사이에 "끼워 넣었지"11 일 동안 문화를 유지했다. 왼쪽 coluMN은 이전과 콜라겐 매트릭스 내에서 proliferating ASCs을 묘사하고 스핀들과 같은 형태를 데리고 나타납니다. 오른쪽 열에는 ASCs 멀리 CSMs에서 마이 그 레이션 및 PEG-섬유소 겔 전체에 튜브와 같은 구조를 형성을 묘사.

토론

ASCs은 고립과 다양한 세포 유형으로 차별화할 수있는 능력 자신의 용이성에 대해 잘 알려져 있습니다. 본 원고에서 설명한 기법을 통해, 우리는 동시에 여러 biomatrices 이러한 세포를 노출함으로써 ASCs의 소성을 이용하실 수 있습니다. 세포가 자신의 CSM베이스에서 떨어져 마이 그 레이션과 그 주변의 세포외 환경을 입력할 때, 세포는 비계에서 실수를 타고 중 "stemness"(콜라겐)을 유지하거나 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 장비의 명칭	회사	카탈로그 번호	댓글
행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)	Gibco	14,175	소모품
태아 소 혈청	Hyclone	SH30071.03	소모품
Collagenase 타입 II	시그마 - 올드 리치	C6685	소모품
70 μm의 나일론 메쉬 필터	BD Biosciences	352,350	소모품
100 μm의 나일론 메쉬 필터	BD Biosciences	352,360	소모품
MesenPRO 성장 매체 시스템	Invitrogen	12746-012	소모품
L-글루타민	Gibco	25,030	소모품
CaCl 2 0.2 H 2 O	시그마	C8106	소모품
T75 조직 배양 플라스크	BD Biosciences	137,787	소모품
키토산	시그마 - 올드 리치	448,869	소모품
초산	시그마 - 올드 리치	320,099	소모품
N-Octanol	Acros의 생명체	150,630,025	소모품
솔비 - 모노 Oleate	시그마 - 올드 리치	S6760	소모품
수산화 칼륨	시그마 - 올드 리치	P1767	소모품
아세톤	피셔 과학	L-4859	소모품
에탄올	시그마 - 올드 리치	270,741	소모품
Trinitro Benzenesulfonic 산성	시그마 - 올드 리치	P2297	소모품
염산	시그마 - 올드 리치	320,331	소모품
에틸 에테르	시그마 - 올드 리치	472-484	소모품
8 μm의 조직 문화 플레이트 삽입물	BD Biosciences	353,097	소모품
1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브	어부	05-408-129	소모품
MTT 시약	Invitrogen	M6494	소모품
디메틸 Sulfoxide	시그마 - 올드 리치	D8779	소모품
Qtracker 셀 라벨 키트 (Q트래커 655)	분자 프로브	Q2502PMP	소모품
한 콜라겐을 입력	Travigen	3447-020-01	소모품
수산화 나트륨	시그마 - 올드 리치	S8045	소모품
12 음 조직 배양 플레이트	BD Biosciences	353,043	소모품
피브리노겐	시그마	F3879	소모품
트롬빈	시그마	T6884	소모품
폴리에틸렌의 Benztriazole 금지	Sunbio	DE-034GS	소모품
트리스 버퍼 타블렛 (산도 7.6)	시그마	T5030	소모품
원심 분리기	Eppendorf	5417R	동등pment
궤도 흔드는	뉴 브 런 즈윅 Scienctific	C24	장비
에어 5 % CO 2와 Humidified 인큐베이터	써모 과학	모델 370	장비
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형광 / 라이트 현미경	올림포스 산	IX71	장비
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전자 현미경 검사	칼 자이스 혈구 MicroImaging	레오 435 부사장	장비
전송 전자 현미경	JEOL	JEOL 1230	장비