Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

Resumo

Este protocolo é focado na utilização a capacidade inerente de células estaminais para tomar cue a partir de sua matriz circundante extracelular e ser induzidas a diferenciar-se em múltiplos fenótipos. Este manuscrito métodos estende nossa descrição e caracterização de um modelo utilizando um hidrogel de camada dupla, composto de PEG-fibrina e colagénio, ao mesmo tempo, co-diferenciar células-tronco adiposas ¹.

Resumo

Polímeros naturais ao longo dos anos ganharam mais importância devido à sua biocompatibilidade hospedeiro e capacidade de interagir com células in vitro e in vivo. Uma área de investigação que tem a promessa em medicina regenerativa é o uso combinatória de novos biomateriais e células estaminais. Uma estratégia fundamental no campo da engenharia de tecidos é o uso de tridimensional andaime (por exemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogéis, micro / nano partículas) para dirigir a função da célula. Esta tecnologia tem evoluído a partir da descoberta de que as células precisam de um substrato sobre o qual podem aderir, proliferar, e expressar seu fenótipo diferenciado celular e função ^2-3. Mais recentemente, tem sido também determinado que as células não só a utilização destes substratos para a adesão, mas também interagir e tomar pistas a partir do substrato da matriz (matriz, por exemplo, extracelular, ECM) ^4. Portanto, as células e andaimes ter uma ligação recíproca queserve para controlar o desenvolvimento do tecido, organização e função final. As células-tronco adiposas (ASC) são mesenquimais, as células estaminais hematopoiéticas não-apresentar no tecido adiposo que podem exibir multi-linhagem diferenciação e servir como uma fonte prontamente disponível de células (isto é pré-vascular endotélio e pericitos). Nossa hipótese é que as células-tronco derivadas de tecido adiposo pode ser direcionado para diferentes fenótipos simultaneamente, bastando co-cultura-los em matrizes bifásicos ^1. O nosso laboratório é focado sobre a cicatrização de feridas dérmica. Para este fim, foi criada uma única matriz composta a partir de os biomateriais naturais, fibrina, colagénio, quitosano e que pode imitar as características e funções de um ambiente de cicatrização da ferida dérmica específico ECM.

Protocolo

1. Isolamento de células-tronco adiposas (ASC) ^{1, 5}

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Isolar adiposo epididimal e perirenal rato e lavar com solução de Hank estéril tamponada de sal (HBSS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), como ⁵ descrito anteriormente. Este estudo foi conduzido em conformidade com o Animal Welfare Act, os regulamentos de execução do bem-estar animal e de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
2. Picar o tecido e transferir 1-2 g em 25 mL de HBSS contendo FBS a 1% para um tubo de 50 ml e centrifugar a 500 g durante 8 minutos à temperatura ambiente.
3. Recolher o de flutuação livre camada de tecido adiposo e transferência para 125-mL Erlenmeyer e trata-se com 25 mL de colagenase tipo II (200 U / mL) em HBSS durante 45 min a 37 ° C num agitador orbital (125 rpm).
4. Retire cuidadosamente a fração líquida (abaixo da camada de petróleo e adiposo) por pipetagem e filtrá-lo sequencialmente através de um 100 - filtro de malha de nylon mM - mM e 70. Centrifugar o filtrado a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, e lavar a pelete duas vezes com 25 mL de HBSS.
5. Ressuspender o sedimento de células em 50 mL de meio de crescimento (Meio MesenPRO RS Basal) suplementado com MesenPRO Suplemento de Crescimento RS, antibiótico-antimicótico (100 U / mL de penicilina G, 100 ug / mL de sulfato de estreptomicina, e 0,25 ug / mL de anfotericina B), e 2 mM de L-glutamina e as células de pipeta em dois frascos T75 (25 ml / balão).
6. Cultura da ASC em um 5% de CO _{2-humidificada} incubadora a 37 ° C (passagem 2-4 ASC são utilizados para todas as experiências).

2. Preparação de microesferas (MCS)

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. MCS são preparados por um processo de emulsificação de água-em-óleo, juntamente com uma técnica de coacervação iónica usando o nosso protocolo anterior ^5. Emulsionar uma solução aquosa de quitosano (6 mL de 3% w / v de quitosano em 0,5 M de ácido acético) em 100 ml de uma mistura de fase de óleo consistindo em óleo de soja, n-octanol (1:2 v / v) e 5 % de sorbitano-mono-oleato de emulsionante (Span 80), utilizando sobrecarga (1700 rpm) e agitação magnética (1000 rpm) simultaneamente em sentidos opostos. Este método de dupla resultará uma mistura que micelas formadas no início antes de reticulação ocorre podem permanecer em solução e não para assentar no fundo. Além disso, a barra de agitação magnética SIDA em DE-agregação de quitosano durante micela formação e rigidization.
2. Agita-se a mistura continuamente agitada durante aproximadamente 1 hora até uma emulsão de água-em-óleo estável é obtido. Iniciar transversal iónico ligação com a adição de 1,5 mL de 1% de hidróxido de w / v de potássio em n-octanol min a cada 15 durante 4 h (24 ml no total)
3. Depois de se completar a reacção de reticulação, lentamente, decantar a fase de óleo da mistura contendo CSM e imediatamente adicionar a 100 mL de acetona, a solução se tornar turva, devido ao resíduo de óleo. Após 5 minutos, decanta-se, adicionar um adicional de 100 mL de acetona e incubar durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, a re-lavagem das pérolas com acetona durante cinco minutos. Depois de realizar estas série lava a solução deve ter virado claro, se não continuar a lavagem até que todo o óleo é removido ea solução de acetona é clara.
4. Secam-se as esferas recuperados em um exsicador de vácuo e analisa-se sem processamento adicional. É possível determinar o tamanho médio de partícula CSM, área de superfície por miligrama, ea unidade de volume cúbico usando um analisador de tamanho de partícula.
5. Para as experiências subsequentes, lavar o CSM três vezes com água estéril para remover os sais residuais e esterilizar por lavagem durante a noite com 5 mL de etanol absoluto.

3. Determinaro número de grupos amino livres em MCS

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Determinar o número de grupos amino livres presentes na MCS após transversal iónico ligando usando o benzenossulfónico trinitro (TNBS) ensaio de ácido de Bubnis e Ofner ^6. Incubar 5 mg de microesferas com 1 mL de 0,5% de solução de TNBS em um tubo de vidro de 50 mL durante 4 h, a 40 ° C e hidrolisar com a adição de 3 mL de HCl 6N a 60 ° C durante 2 h.
2. Arrefecer as amostras à temperatura ambiente e extrair os TNBS livres por adição de 5 mL de água desionizada e 10 mL de éter etílico.
3. Aquecer uma aliquota de 5 mL da fase aquosa para 40 ° C num banho de água durante 15 min para evaporar qualquer éter residual, arrefecer até à temperatura ambiente, e diluir com 15 mL de água.
4. Medir a absorvância a 345 nm com um espectrofotómetro com solução TNBS sem quitosana como em branco eo quitosano utilizado para CSM preparação para determinar o número total de grupos amino. Estimar o número de grupos amino livres da MSC em relação ao quitosano.

4. Carregando ASC no CSM

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Equilibrar 5 mg de MCS esterilizados de seção 2,5 em HBSS estéril durante a noite e adicionar a um 8 - mM tamanho dos poros da membrana de inserção placa de cultura (24-bem placa).
2. Depois de os MCS se estabeleceram para a membrana, aspirar cuidadosamente os HBSS e adicionam-se 300 uL de meio de crescimento para o interior da inserção e 700 uL de meio de crescimento para o exterior do inserto.
3. ASC Ressuspender a uma concentração adequada (1 × 10 ^{4 e} 4 × 10 ⁴⁾ em 200 uL de meio de crescimento e de sementes ao longo do CSM dentro do inserto placa de cultura. O volume final de meio de cultura dentro da inserção, após a semeadura, é de 500 uL.
4. Incubcomeu o seeded ASC em MCS por 24 h em um 5% de CO ₂ incubadora humidificada a 37 ° C.

5. Determinação da porcentagem de ASC Carregando e viabilidade celular em MCS

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Após a incubação, pipeta CSM a ASC-carregado num tubo de microcentrífuga esterilizado 1,5 mL, sem perturbar as células que migraram para a membrana de inserção.
2. Remover o meio residual e adicionar 250 uL de meio de crescimento fresco para o tubo.
3. Para cada tubo, adicionar 25 ul de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] solução (5 mg / mL) e incubar durante 4 h em um 5% de CO ₂ humidificada incubadora a 37 ° C.
4. Após a incubação, o meio de remover, adicionar 250 uL de sulfóxido de dimetilo, e vórtice a mistura durante 2-5 minutos para solubilizar o formazan complexo.
5. Centrifugar o CSM em 2700 gdurante 5 min, pipeta fora o sobrenadante e determinar a sua absorvância a 570 nm de comprimento de onda e 630 nm, utilizando um leitor de placas de padrão, de acordo com as especificações do fabricante MTT.
6. Determinar o número de células associadas com os MCS em relação aos valores obtidos a partir de números definidos ASC cultivadas para desenvolver uma curva padrão.

6. Preparação e Caracterização de ASC-CSM incorporado em PEG-fibrina Gels

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Polietileno glicol (PEG) de fibrina hidrogel (PEG-fibrina) preparado por Suggs et al ⁷ por dissolução do succinimidil glutarato polietileno glicol modificado (PEG; 3400 Da). Utilizando 4 mL de solução salina tamponada com tris (TBS, pH 7,8) e um filtro esterilizar com um filtro de 0,22 mícrons imediatamente antes do início da experiência. PEG dissolvido só é eficaz nesta aplicação para as primeiras horas 3-4.
2. Misturar 500 μ l de estoque de fibrinogénio (40 mg / mL em TBS, pH 7,8) e 250μl de PEG estoque em um poço de cultura de uma placa de 6 poços e incubar durante 20 minutos em um 5% de CO ₂ incubadora humidificada a 37 ° C. Esta mistura constitui um rácio de concentração molar de 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogénio.
3. Tome 250 uL de ASC-CSM a uma concentração de 5 mg de CSM, (≈ 2 × 10 ⁴ células) e misturar com a solução de fibrinogénio PEGuilada.
4. Imediatamente adicionar 1 ml de trombina de stock (25U/mL) e tritura-se rapidamente uma vez ou duas vezes com a pipeta. Após a mistura da trombina com o PEG-fibrinogénio, imediatamente colocar a mistura de células-gel em uma placa de 12 poços e incubadas em 5% de CO ₂ incubadora humidificada a 37 ° C durante 10 min para permitir a gelificação completa. Desde o tempo de gelificação é rápido, não tentar segurar a solução de gel dentro da ponteira por mais de 5 segundos. O fibrinogénio peguilado é clivado pela trombina e forma um hidrogel de fibrina PEGuilada. Como th, tale produto gel final é referido como PEG-fibrina.
5. Lavar os géis PEG-fibrina duas vezes com HBSS e incubar com alfa mínimas meios essenciais (α-MEM) suplementado com FBS 10%, em um 5% de CO ₂ incubadora humidificada a 37 ° C.
6. Observar a migração de células de CSM no gel durante um período de 11 dias usando técnicas de microscopia de luz padrão.

7. Preparação e Caracterização de ASC-CSM incorporado em géis de colágeno

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Mistura ASC-CSM (5 mg contendo ≈ 2 × 10 ⁴ células) com colagénio de tipo 1 (7,5 mg / mL), extraído a partir de tendões da cauda de rato de acordo com o método de Bornstein ⁸ e fibrilam depois de ajustar o pH para 6,8 utilizando NaOH 2N.
2. Adicionar a mistura de colagénio-ASC-CSM fibrilada para uma placa de 12 poços e incubar durante 30 min em um 5% de CO ₂ humidified incubadora a 37 ° C.
3. Depois de fibrilação completa, incubar os géis de colagénio-ASC-CSM para até 11 dias em um 5% de CO ₂ incubadora humidificada a 37 ° C.
4. Observar a migração de células de CSM no gel durante um período de 11 dias usando técnicas de microscopia padrão.

8. Desenvolvimento de bifásicos PEG-fibrina (ASC-CSM) Constrói-gel de colágeno

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

1. Para desenvolver a bicamada construir, preparar colagénio e os géis de PEG-fibrina conforme descrito acima, com ligeiras modificações. Resumidamente, para estudar as propriedades migratórias e co-indução de uma única fonte de células-tronco usando dois bioscaffolds, "sanduíche" do ASC-MCS entre o colágeno e os andaimes PEG-fibrina, usando um processo de quatro etapas: 1) Carga ASC em CSM, 2) lançar gel de colágeno fibrilada e uma camada das pérolas ASC-CSM sobre o collagen gel, 3) fundido gel PEG-fibrina sobre o gel de ASC-CSM-colagénio e permitir gel para solidificar, e 4) adicionar meio para bem e inserir a estudar células in vitro ou remover do inserto para aplicações in vivo (ver Figura 1 ).
2. Prepara-se uma tipo 1-1 mL de colagénio (7,5 mg / mL) A mistura tal como descrito acima em 7,1, sem a adição de ASC-CSM à mistura. Colocar a mistura em uma inserção de cultura de tecido de 6 poços (8-iM tamanho de poro) e incubar durante 30 min em um 5% de CO ₂ incubadora humidificada a 37 ° C.
3. Depois de completa a fibrilação camada, sobre o colagénio mg superfície 5 de ASC-CSM (10, 000 células / mg) suspenso em meios de cultura (200 uL). Após as microesferas têm assente sobre o gel, preparar o gel PEG-fibrina conforme descrito na secção 6.0, sem a adição de ASC-CSM-se à mistura, ea camada da solução de fibrinogénio / trombina PEGuilada sobre as camadas de colagénio ASC-CSM-. Ao preparar o gel PEG-fibrina, usar 250 uL de meio de cultura celular, em substituição de tele uL de meio contendo 250 das células.
4. Uma vez concluída, incubar as construções durante 30 min em um 5% de CO ₂ incubadora humidificada para alcançar a gelificação completa antes de alimentar a construção com meio de cultura.
5. Após a gelificação completa, o local de 1 mL de meio na câmara superior sobre o construto e 3 mL de meio na câmara inferior.

9. Fazendo Solutions Banco

Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.

• Estoque de cloreto de cálcio (40 mM): Use somente CaCl ₂ .2 H ₂ O. Dissolve-se 588,4 mg de _CaCl2 0,2 _H2O com 100 ml de água desionizada. Esterilizar utilizando um filtro de 0,22 um.
• Polietileno-glicol: PEG é altamente reactivo com o oxigénio e pode tornar-se oxidado quando exposta ao ar ambiente. Como tal, o PEG deve ser armazenado sob azoto (N ₂₎ atmosfera. Accurately pesar 32 mg em um tubo de centrífuga de 2 ml (certificar-se para purgar os tubos com N ₂ antes da utilização) e armazenar a -80 ° C até estar pronto para utilização. Dissolve-se 32 mg de PEG em 4 mL de TBS solução antes da utilização.
  As soluções a seguir deve ser feita antes de cada nova experiência.
  
• TBS solução: (pH 7,75-7,77 a 25 ° C; pH a 25 ° C é muito critico). Para preparar 15 ml de solução de TBS, cuidadosamente dissolver um comprimido tampão no filtro esterilizado de água desionizada e ajusta-se o pH desejado. Não guarde a solução estoque de preparar-la fresca o tempo todo.
• Solução de fibrinogénio: (40 mg / ml). Dissolve-se pó de fibrinogénio em TBS para fazer a concentração de fibrinogénio 40 mg / ml. Dissolve-se durante a noite com um agitador magnético, a 4 ° C. É mais fácil para dissolver a quantidade 1-g inteiro com a quantidade necessária de TBS. No dia seguinte, remover o fibrinogénio a partir de 4 ° C (geralmente turva) e permitir que elepara aquecer num banho de água até que uma solução homogénea é obtida. Finalmente, filtrar esterilizar o fibrinogénio utilizando um filtro de 0,45 mícrons.
• A trombina solução (25 Unidades / mL): Para tornar a solução de trombina, pesar a quantidade necessária e que se dissolvem com a mM 40 preparada _CaCl2 0,2 H ₂ O. É sempre uma boa prática usar o frasco inteiro de trombina para fazer o estoque. Exemplo: Dissolver uma garrafa de 5 kU trombina com 200 mM de _CaCl2 0,2 _H2O, alíquota e armazenar a -20 ° C.

10. Os resultados representativos

O objetivo geral da técnica apresentada aqui é demonstrar o potencial de diferenciação dirigida por matriz simultânea de ASC em múltiplos fenótipos usando CSM como um veículo de entrega. Nós demonstramos uma estratégia in vitro para entregar as células-tronco a partir de MCS em uma bicamada de colágeno-PEG-fibrina andaime. Caracterização da ASC integra a presente reveale andaimed que ASC-carregados MCS pode ser "imprensada" entre uma camada de colágeno e PEG-fibrina simultaneamente e diferencialmente tomar sugestão de ambos os ambientes extracelulares a prosperar sob as novas condições. O primeiro caracteriza-se a capacidade para o sistema modelo para manter a viabilidade celular e capacidades migratórias. O colagénio suportado a capacidade de ASC para manter a sua "stemness", como foi demonstrado pela sua expressão de Stro-1 e sua morfologia de fibroblastos-like (Figura 2D e 2F). Em contraste, o PEG-fibrina induzida as ASC para diferenciar para um fenótipo vascular, como é demonstrado pela sua morfologia estrutura tubular semelhante, a sua expressão em células específicas endotelial do factor de von Willebrand (Figura 2E e 2G), e pericyte expressão específica de NG2 e crescimento derivado de plaquetas beta do receptor do factor (PDGFRβ) (dados não mostrados). Além disso, estes fenótipos observados apareceu a ocorrer no início da cultura e foram mantidas durante 11 dias, como é demtrada na Figura 3.

Tabelas e Figuras

Benefícios da bicamada Construir:

• O andaime sozinho sem células podem funcionar como um andaime bioativo.
• PEG-fibrina pode induzir as células estaminais para diferenciar sem a adição de factores de crescimento.
• O colagénio pode auxiliar na manutenção do fenótipo de células estaminais de ASC.
• Uma construção de bicamada pode ser utilizado como um substrato activo para outros tipos de células para migrar e proliferar (por exemplo, células endoteliais, fibroblastos, queratinócitos, células musculares lisas, pericitos).
• Ele pode ser usado com andaimes duro-engenharia de tecidos como o osso hydroxyaptite ou desmineralizada para regenerar tecidos duros e moles.
• Ele pode ser utilizado para desenvolver um multi-camadas, construto tecido de diversa (como dermo-vascular, vascular-epitelial, dérmica-vascular-hipodérmica, etc.)
• Ele utiliza uma única fonte de células para desenvolver simultaneamentecompartimentos multicelulares.
• Ele tem o potencial para integrar com o tecido do hospedeiro, uma vez que é de origem natural.
• CSM dentro da construção de gel proporciona uma plataforma para as células a migrar a partir de.
• A quitosana, usado para preparar CSM, é um conhecido químico ativo atrativo.
• O conceito geral aplicada neste protocolo de "dirigida por matriz diferenciação de células-tronco" pode ser aplicado a células estaminais tipos outros. No entanto, mais estudos são necessários para determinar a viabilidade da matriz baseada diferenciação. A bicamada gel andaime pode atuar como um reservatório para entregar as células de uma forma sustentada e controlada.
• Após a reconstrução, os géis podem ainda ser separado em componentes individuais.

Figura 1. Esquemático que representa o objectivo global eo processo da técnica. 1) As células-tronco adiposas (ASC) são eisaded para microesferas de quitosano. 2) O colagénio é então vertida para uma inserção de 6 poços, o pH ajustado para fibrilar o colagénio ea inserção colocada em uma câmara de placa de 6 poços. As esferas ASC-carregadas da CSM são, então, colocado sobre o colágeno. 3) O fibrinogénio é ligado a PEG, em seguida, vertida sobre o colagénio (ASC-CSM) e gelificada pela adição de trombina. 4) A construção bicamada final pode então ser removido a partir da inserção de cultura e utilizado para in vitro ou in vivo análise.

Figura 2. Caracterização de ASC cultivadas dentro de colagénio e as matrizes de PEG-fibrina 3D. A) fotomicrografia de contraste de fase de isolado ASC passadas e mantido usando rotina 2-dimensionais técnicas de cultura de células. As fotomicrografias B, D, E e F ilustram ASC-CSM cultivadas num gel de colagénio 3-dimensional; que C, E, e G mostram ASC-CSM cultivadas dentro de um 3-dimensional PEG-fibrina gel, tanto no dia 12. Em B e C), ASC são mostrados migrar para longe da esfera CSM em ambos os tipos de andaime. ASC parecem ter uma achatada, morfologia fusiforme em colagénio (B), mantendo a sua expressão do marcador de células estaminais Stro-1 (D; seta). Quando cultivados em PEG-fibrina ASC exibem mais do tubo estruturas semelhantes e são induzidas para expressar tais marcadores de células vasculares, como Factor de von Willebrand (E). Microscopia eletrônica de transmissão mostra a morfologia típica demonstrada pela ASC dentro de cada cadafalso. ASC em gel de colagénio parecem ter filopodia menor (fl) que se estende a partir do corpo da célula (F), enquanto que ASC tipicamente formados luminais (rotulado L) estruturas (g; seta).

Figura 3. A análise morfológica de ASC-MCS entre bicamadas de colágeno e PEG-fibrina géis. ASC-MCS foram "sanduíche" entre colagénio e PEG-fibrina géis e mantidas em cultura durante 11 dias. O Colu esquerdamn representa ASC migram e proliferam dentro da matriz de colágeno e parece assumir uma morfologia fusiforme. A coluna da direita mostra ASC migram longe os MCS e formando tubo estruturas semelhantes ao longo do gel PEG-fibrina.

Discussão

ASC são bem conhecidos pela sua facilidade de isolamento e capacidade de diferenciar para vários tipos de células. Com as técnicas descritas neste manuscrito, somos capazes de explorar a plasticidade da ASC por expor essas células para biomatrices múltiplos simultaneamente. Como as células migram para longe de sua base CSM e entrar no seu meio ambiente extracelular, as células tomar sugestão do andaime e pode manter "stemness" (colágeno) ou ser induzido a diferenciar os tipos de células para vascula...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / equipamentos	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175	Consumível
Soro Fetal Bovino	Hyclone	SH30071.03	Consumível
Colagenase do Tipo II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumível
70-iM filtro de rede de nylon	BD Biosciences	352350	Consumível
100-iM filtro de rede de nylon	BD Biosciences	352360	Consumível
MesenPRO Sistema Meio de Crescimento	Invitrogen	12746-012	Consumível
L-Glutamina	Gibco	25030	Consumível
CaCl 2 .2 H 2 O	Sigma	C8106	Consumível
T75 frasco de cultura de tecidos	BD Biosciences	137787	Consumível
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumível
Ácido Acético	Sigma-Aldrich	320099	Consumível
N-octanol	Acros Organics	150630025	Consumível
Sorbitano-mono-oleato	Sigma-Aldrich	S6760	Consumível
Hidróxido de Potássio	Sigma-Aldrich	P1767	Consumível
Acetona	Fisher Scientific	L-4859	Consumível
Etanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumível
Trinitro benzenossulfónico	Sigma-Aldrich	P2297	Consumível
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	320331	Consumível
Éter etílico	Sigma-Aldrich	472-484	Consumível
8 m de tecido Placa Insere Cultura	BD Biosciences	353097	Consumível
1,5 ml tubos de microcentrífuga	Pescador	05-408-129	Consumível
Reagente MTT	Invitrogen	M6494	Consumível
Sulfóxido de dimetilo	Sigma-Aldrich	D8779	Consumível
Qtracker celular Labeling Kit (QRastreador 655)	Sondas moleculares	Q2502PMP	Consumível
Colágeno tipo 1	Travigen	3447-020-01	Consumível
Hidróxido de Sódio	Sigma-Aldrich	S8045	Consumível
12-Bem Cultura Pratos Tecido	BD Biosciences	353043	Consumível
Fibrinogênio	Sigma	F3879	Consumível
Trombina	Sigma	T6884	Consumível
Derivada Benztriazole de Polietileno	Sunbio	DE-034GS	Consumível
Tampão de Tris Tablet (pH 7,6)	Sigma	T5030	Consumível
Centrifugar	Eppendorf	5417R	Equivolvimento
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipamento
Incubadora de CO umidificado com Air-5 2%	Thermo Scientific	Modelo 370	Equipamento
Agitador	IKA	Visc6000	Equipamento
Agitador Magnético	Corning	PC-210	Equipamento
Exsicador de vácuo	-	-	Equipamento
Analisador de Tamanho de Partícula	Malvern	STP2000 Spraytec	Equipamento
Banho de água	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipamento
Espectrofotômetro	Beckman	Beckman Coulter DU Espectrofotômetro 800UV/Visible	Equipamento
Vórtice	Diagger	3030a	Equipamento
Leitora	Molecular Devices	Spectramax M2	Equipamento
Luz / microscópio de fluorescência	Olimpo	IX71	Equipamento
Microscópio confocal	Olimpo	FV-500 Laser Scanning microscópio confocal	Equipamento
Microscópio Eletrônico de Varredura	Carl Zeiss microfilmagem	Leo 435 VP	Equipamento
Microscópio eletrônico de transmissão	JEOL	JEOL 1230	Equipamento