전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

요약

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

초록

세포 분열 동안 두 딸 세포 사이의 염색체의 동등한 배포 유전자 안정성 ¹ 보장을위한 전제 조건입니다. 염색체 분리시 부정확 한이 종의 특징이며 진행성 질환 ^2-4와 관련된. 스핀들 조립 검사 점 (SAC)는 모든 단일 염색체는 mitotic 스핀들 ¹ 안정적인 바이폴라 첨부 파일을 확립 할 때까지 다시 metaphase에서 세포를 보유하고 mitotic 감시 메커니즘입니다. SAC는 활성화와 간섭에 의해 그 기능을 발휘 APC / C securin와 cyclin B의 proteolysis하므로 염색체 분리와 mitotic 출구를 차단하는 subunit Cdc20. 염색체의 부적절한 첨부 파일 SAC 신호의 입을 방지하고 문제가 염색체 missegregation, aneuploidy와 악성 growths ^일을 피하기 위해 해결 될 때까지 APC / C ^Cdc20의 지속적인 억제가 발생합니다.

내가 연설을 대부분의 연구APC / C에 의존 proteolysis에 부적절한 염색체 첨부 파일의 nfluence는 미소로 염색체 첨부 파일을 방해하는 약물을 depolymerizing 또는 미세 소관 - 안정화를 사용하여 스핀들 혼란을 이용했다. 미세 소관의 동력학과 간섭이 교통 및 중요한 규제의 국산화에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 절차는 인공 효과, ^5를 일으킬 위험을 맺습니다.

SAC는에서 유사 분열 동안 APC / cyclin B의 C-의존 proteolysis을 방해하는 방법 공부하는 세포 집단을 교란되지 않은, 우리는 허용 히스톤 H2-GFP-기반 시스템을 설립 metaphase mitotic 염색체의 정렬 및 cyclin B ⁶ proteolysis의 동시 모니터링 .

proteolytic 프로필을 묘사하기 위해, 우리는 C-터미널 SNAP 잔기 ⁶ (그림 1) 키메라 cyclin의 B 기자 분자를 생성. 자체 라벨 반응에서 SNAP-잔기가 함께 공유 결합 채권을 형성 할 수 있습니다alkylguanine - 반송파 (SNAP 기판) ^7,8 (그림 1). SNAP 기판 분자 쉽게 사용할 수 있으며 다른 fluorochromes의 폭 넓은 스펙트럼을 가지고 다니십시오. 키메라 cyclin B-SNAP 분자는 성장 매체 ⁷ (그림 1)에 막 투과성 SNAP 기판의 추가에 표시됩니다. 라벨 반응 후, cyclin B-SNAP 형광 강도는 펄스 추격전 반응과 같은 방식으로 형광 강도 cyclin B 저하 ⁶ (그림 1)의 수준을 반영에 떨어. Google 시스템은 병렬 셀 (또는 여러 세포 집단)의 큰 숫자 mitotic APC / C에 의존 proteolysis의 모니터링을 용이하게한다. 따라서, 시스템은 에이전트 / 전환을 anaphase 할 metaphase에서 proteolytic 활동을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별 할 수있는 귀중한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 유사 분열 동안 cyclin B의 합성으로 최근 중요한 mechanis으로 제안 된안정적인 cyclin B 표현 수준 ^9,10를 유지하여 마우스와 인간의 mitotic 블록을 조성하는데있어,이 시스템은 우리가 균형 잡힌 평형 ^{6 항} 중 어느 한 요소로 cyclin의 B의 proteolysis를 분석 할 수있게.

프로토콜

1. 현미경 상공 회의소 슬라이드에 U2OS 기반 Cyclin B-SNAP 리포터 세포 (클론 11 셀 ⁶⁾ 심는

1. 최소 48 시간의 로그 단계에서 비동기 적으로 성장 할 수 있었다 subconfluent SNAP 기자 세포를 Trypsinize.
2. 8 잘 현미경 챔버 (세포의 지속적인 배포)과 함께 일하는 것.

현미경 챔버의 전체 표면 원심 분리기 만 세포에서 일정한 분포 8 잘 현미경 챔버에 세포를 퍼 뜨리고 및 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 350 μl (10 % 태아 소 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충에 resuspend에 대한 나트륨 pyruvate). 현미경 챔버 (그림 2)에 세포 현탁액을 전송합니다.

8 잘 현미경 챔버 (중앙에 최대 세포 밀도)의 협력을 참조하시기 바랍니다.

현미경 chamb의 중심에 높은 밀도로 세포의 퍼 뜨리고 들어음, 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 300 μl로 챔버를로드합니다. 현미경 챔버의 중심 (그림 2)주의 깊게 5,000 셀을 추가합니다.

96 잘 특별 광학 플레이트 (세포의 지속적인 배포)과 함께 일하는 것.

잘의 전체 표면에 걸쳐 일정한 분포에서 96 잘 플레이트로 세포의 퍼 뜨리고를 들어, 5,000 세포를 원심 분리기와 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 300 μl에 resuspend. 96 - 웰 플레이트에 세포 현탁액을 전송합니다. 필요한 세포 함유 우물의 총 수에 따라 휴대폰 번호 및 정지 매체의 총 부피 (그림 2)를 조정할 수 있습니다.

96 잘 특별 광학 플레이트 (중앙에 최대 세포 밀도)의 협력을 참조하시기 바랍니다.

96 잘 플레이트로 세포의 시딩를 들어, 신중하게 smal에 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 15 μl에 1,500 셀을 추가잘의 중심 (그림 2)에 세포의 성장에 제한을 달성하기위한 각도의 중심부에 난 드롭.

3. 시드 세포 표준 세포 배양 조건 (37 ° C, 100 % 공기 습도, 5 % CO _2)에 따라 최소 18 시간에 성장 할 수 있습니다.

2. SNAP 기판과 리포터 세포의 착색

1. 전에 착색 절차의 시작 부분에 30 분은 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체의 aliquots 37까지 따뜻하게 할 수 있습니다 ° C.
2. SNAP 기판의 취급이 용이합니다 (우리의 경우 TMR 스타에서) -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 400 μm의 주식 솔루션에 집중을 얻기 위해 DMSO에 TMR 스타를 해산
3. 이전 착색에, 1 μm의 최종 라벨 농도를 얻기 위해 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C) 200 μl에 TMR 스타 주식 솔루션의 0.5 μl를 희석.
4. 비동기 적으로 성장하는 세포의 정상적인 성장 매체를 제거하고 리터에 품다표준 문화 조건에서 25 분을 위해 매체를 abeling.
5. 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C)와 중간 및 세척 세포 네 번 라벨 제거합니다. 30 분을위한 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C) 300 μl에 세포를 배양. 이전 현미경을 운반에 잔류 언 바운드 SNAP 기판을 제거하는 신선한 페놀 붉은 무료로 정상적인 성장 매체 (37 ° C)와 매체를 교체하십시오.
6. 미리 예열에 스티로폼 상자에 현미경으로 전송 셀 (37 ° C) 온도 편차를 최소화하기 위해 열 블록.

3. 형광 강도 측정

1. 전에 분석에 두 시간 ° C 건조 모드에서 원하는 온도로 모든 구성 요소를 사용하여 전체 현미경을 가져다하기 위해 37 기후 챔버의 공기 온도를 조정합니다. 사전 가열 습도를 설정하기 전에 현미경에 결로 및 후속 손상을 방지하는 것이 중요합니다.
2. 공기 습도 t을 조정O 60% 및 분석의 시작하기 전에 CO _2-5%.
3. 스캔 ^ R 취득 소프트웨어를 시작하고 표준 설정 (표 1 참조) 정의합니다.
4. 분석 할 우물의 위치를​​ 정의합니다.
5. Δt (수집 사이클 타임) 및 취득주기의 절대 수를 정의합니다.
6. 우물의 더 많은 분석이 필요하다면, 하드웨어 자동 초점을 선택, 그렇지 않으면 혼자 소프트웨어 자동 초점을 사용하기에 충분합니다.
7. 인수를 시작하고 처음 두 인수 사이클에 대해 감독한다. 필터가 변경되어 해당 TMR 스타 이미지 (그림 3) 인수되기 전에 현미경 해당 채널의 첫 번째 이미지의 후속 취득과 함께 히스톤 H2-GFP 신호에 초점을 맞출 것이다. 이것은 다시 다음주기를 반복하기 전에 잘 내의 검사 할 우물의 각에 대한 모든 위치에 대해 반복됩니다.

4. Proteolytic 프로필 U 분석스캔 ^ R을 노래

1. 스캔 ^ R 분석 소프트웨어를 시작하고 세포 핵으로 이미지를 분석과 같은 신호 강도와 인근 세포를 분리하는 데 큰 도움이 분수령 알고리즘을 기반으로하는 임계 값을 사용하여, 주요 개체로 정의 된 히스톤 H2-GFP에 의해 시각화. 세포질과 핵으로 구성된 subobject는 TMRstar 분석을 위해 생성되어야합니다. (주 객체의 중요 속성 X와 Y 위치, 시간, 및 최대이며 주요 개체와 TMRstar subobject을위한 영역으로 나눈 전체 강도에 대한 GFP의 농도를 의미합니다.)이 분석 과정은 큰 데이터로 인해 몇 시간이 걸릴 수 있습니다 수량.
2. 분석 주요 개체 (그림 4)에 할당 된 시간이 지남에 따라 subobject 말은 TMR 별 형광 강도를 (셀 추적), 시각화 모드를 추적 변경합니다. 검사 할 셀의 수는 적어도 140 사이클을 지속 해당 측정에 게이팅 의해 H2-GFP의 높은 최대 강도로 좁혀 할 수 있습니다. 찾고세포의 큰 숫자에 첫 번째 대표하고 객관적인보기 (그림 4) 있습니다.
3. 단일 세포 수준 (그림 5A)에서 동시에 히스톤 H2-GFP 및 TMR 스타 형광를 시각적으로 관심 셀 추적을 선택합니다.
4. 관심있는 셀을 마우스 오른쪽 클릭을 사용하고 히스톤 H2-GFP 및 cyclin B-SNAP 매번 지점에 대한 TMR 스타의 그림에 내보낼 사진 갤러리를 생성합니다.
5. 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 및 게이트 관심 셀이 X 대 Y 점 플롯 (그림 5B)에 표현된다 지역의 인구 모드로 변경합니다.
6. 게이트 지역에 새로운 점 플롯 창을 적용하고 시간이 지남에 따라 TMR 스타 형광 강도 (그림 5C)를 의미 표시합니다.
7. 자세한 계산 용 Microsoft Excel로 내보내기 데이터 (시간과 형광 강도).

5. 대표 결과

무화과우레 5D와 5E 호야는 셀의 TMR 별 형광 강도 곡선으로 표현 cyclin B 동력학을, 묘사 그 염색체 misalignment의 흔적 (그림 5E 호야)없이 일반 유사 분열을 통해 진행. 셀 prometaphase ⁶ 입력 할 때 isomorphic 창 (다이어그램에서 밝은 영역)에 도달 할 때까지 핵 봉투 고장 (NEBD 등 빨간색 삼각형으로 표시)에 따라 세포질의 압축되면, TMR 스타 형광 강도는 갑작스런 증가를 보여줍니다. 형광 강도는 prophase와 metaphase를 통해 셀 수익금만큼 안정적인 수준으로 유지 한 후 염색체의 모든 (그림 5D와 5E 호야) 안정적인 metaphase 플레이트를 설립 한 후 빠른 속도로 떨어지기 시작합니다. 이 드롭 anaphase (곡선에 파란색 점) 동안 염색체 분리를 앞에. 후반 유사 분열에서 염색질은 decondense 시작 (파란색 바)과 형광 강도 곡선이 접근하는 동안 셀은 계면 형태를 채택유사 분열 (그림 5D와 5E 호야) 전 고원보다 낮은 고원.

자동 초점 설정	히스톤 H2-GFP (주 객체 수집 설정)	TMR 스타 라벨이 Cyclin B-SNAP (수집 설정)	취득주기 시간 반복
거친 자동 초점 + / -39 μm 24 층 정밀 자동 초점 + / -5.4 μm 14 층	GFP 필터 설정 : 노출 시간 : 100 밀리 초 빛의 세기 : 25 %	TRITC 필터 설정 : 노출 시간 : 150 밀리 초 빛의 세기 : 33.3 %	2-5 분.
GFP 필터 설정 : 노출 시간 : 12 밀리 초 빛의 세기 : 12.5 %			최대 지속적인 분석의 48 시간 (60 %의 감소 공기 중 습도에 의해 제한)에

표 1. cyclin B의 proteolysis의 분석에 사용 된 표준 설정입니다. 히스톤은 H2-GFP는 cyclin B-SNAP 형광 강도의 측정을 위해 초점 비행기를 정의하는 참조 구조로 사용되었다. 누적 광독성을 피하기 위해 이미지 수집 설정에 비해 초점 절차를 수행하는 동안 광도가 낮은 있습니다.

1 그림. 내생 단백질과 유사한 열화 특성과 키메라 cyclin의 B 유도체의 표현을 통해 cyclin B의 proteolysis의 측정의 개략도. 펄스 - 체이스 라벨 후 형광 강도의 하락은 APC / C-활동을 측정하기위한 한 방법입니다.

그림 2. 8도 슬라이드 또는 96 잘 접시에 세포의 분석.의 정기 배포우물의 표면에 걸쳐 셀 300 μl의 최종 볼륨에 resuspension에 의해 달성된다 만 단일 또는 몇 위치를 수동으로 분석을 위해 정의되는 경우 권장합니다. 중심 지역에서 세포의 농축은 prefilled 또는 빈 우물의 중심에 셀의 추가에 의해 달성된다. 이 기술은 다른 우물의 자동 이미지 수집의 경우 권장합니다.

그림 3. 데이터 수집의 순서가. 히스톤 H2-GFP의 A) 검색이 유사 분열 동안 염색체 정렬의 초점 평면 정의 및 모니터링에 사용됩니다. B) TMR 스타 형광 강도의 형광 강도는 cyclin B-SNAP 표시된 펄스 체이스의 절대 금액을 측정하기위한 한 방법입니다.

4 그림. 평균 TMR 별 대표 스캔 ^ R 분석 소프트웨어 기반의 묘사시간이 지남에 따라 형광 강도 (면적으로 나눈 총 TMRstar 강도). 대표 셀 추적 (파란색)의 선택. 해당 이미지 (오른쪽에 표시)의 동시 시각화를 허용 히스톤 H2-GFP (녹색)와 cyclin B-SNAP (빨간색). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5. A + B) XY-점 음모에 관심있는 셀을 나타내는 점의 게이팅을위한 예. C) 시간이 지남에 따라 평균 TMRstar의 형광 강도 (면적으로 나눈 총 TMRstar 강도)의 시각화는 점 플롯을 사용합니다. D + E) Microsoft Excel에서 생성으로 NEBD (핵 봉투 고장)와 염색질 decondensation (파란색 막대) 사이 isomorphic 창 (그림에서 brigher 필드)와 cyclin B-SNAP 대표 형광 강도 곡선. Anaphase는 t로 표시됩니다곡선에서 그는 파란색 점은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

영화는 1. 보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

우리는 여기 cyclin B의 proteolysis 및 염색체 정렬의 동시 모니터링을 용이하게 라이브 셀 이미징 기반의 접근 방식을 제시한다. 이 방법은에서 mitotic 컨트롤의 연구는 단일 세포 수준에서 세포 인구를 교란되지 않은 수 있습니다. Cyclin B 저하 곡선은 APC / C의 활동에 직접 통찰력을 촉진하므로 간접적으로 SAC ^6의 상태를 반영합니다.

이 방법은 비록 스캔 ^ R 소프트웨어를 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
제품의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
리포터 세포 라인	생성 자체는 6 설명	11 기자 세포를 복제 (U2Os 기반 cyclin B-SNAP 표현 세포)
Retroviral cyclin B-SNAP 표현 벡터	생성 자체는 6 설명	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred 무료 DMEM	Gibco	21063-029	FCS, 나트륨 pyruvate, 페니실린 / strepto-mycin과 보완 필요
SNAP-세포 TMR-스타	뉴 잉글랜드 Biolabs	S9105S	DMSO의 주식 솔루션을 400 μM
특별 Opstics 판, 잘 96	Costar	3720
μ-슬라이드 8 잘 ibiTreat	Ibidi	80,826
현미경 단위	하늘	기후 챔버와 IX-81 역 현미경
목표	하늘	UPLSAPO 20x 목적 (NA 0.75)
수집 소프트웨어	하늘	스캔 ^ R 취득 소프트웨어 (v.2.2.09)
분석 소프트웨어	하늘	스캔 ^ R 분석 소프트웨어 (v.1.2.0.6)