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요약

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

초록

셀 / 입자 접착 분석은 질병의 병태 생리에 관련된 생화학 적 상호 작용을 이해하는 데 중요하며 새로운 치료제의 개발에 대한 탐구에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 정적 조건을 이용하여 분석이 생체 내 환경과의 상관 관계를 제한하는 전단에 접착 의존성을 캡처하지 못한다. 생리적 유체 흐름하에 접착력을 정량화 평행 평판 유동 챔버 전단 접착 맵의 생성을위한 다수의 실험이 필요하다. 또, 이들은 생체 내 치수 및 형태를 나타내지 않는 실험 시약 대용량 (~ ml)에 요구한다. 본 연구에서는 미세 유동 장치, SynVivo-SMN 기반 미세 혈관 망을 이용하여 단일 실험에서 전단 접착 맵의 생성을 보여준다. 이 장치는 기하학적 규모, 형태 요소, 흐름의 특징과에있는 세포의 상호 작용을 포함한 생체 내 혈관의 복잡한을 다시체외 형식함으로써 기본에 대한 생물학적 사실적인 환경을 제공하고 세포 행동, 약물 전달 및 약물 발견 연구를 적용했다. 분석은 마이크로 칩의 아비딘 - 코팅 된 표면을 가진 2 μM 바이오틴 - 코팅 입자의 상호 작용을 연구에 의해 입증되었다. 미세 혈관에서 관찰 전단의 전체 범위는 생리적 조건 하에서 입자의 전단지도 대 단일 분석 가능 밀착성이 얻어진다.

서문

세포 - 세포 및 입자 세포의 상호 작용을 연구하는 현재의 분석은 일반적으로 입자 또는 세포가 단백질 행렬 또는 자기편 세포 배양되는 정적 잘 플레이트 형식을 포함한다. 특정 배양 시간의 끝에서, 접착 입자 또는 세포의 숫자는 한 현미경을 사용하여 정량화된다. 이러한 분석은 이러한 상호 작용의 뒤에 생화학 적 프로세스에 중요한 통찰력을 제공하더라도, 키 제한 (미세 혈관의 일반) 생리 학적 유체 흐름의 부족 및 입자 부착에 미치는 영향이다.

이러한 한계를 극복하기 위하여, 시험 관내 유동 챔버는 최근 몇 년 동안 개발되었다. 이러한 흐름 챔버의 일반적인 요소는 생체 내 2 혈관에서 관찰 벽 전단 속도에 맞게 낮은 레이놀즈 수에서 관류 투명 장치이다. 혈관벽은 유량 (C)의 한 표면 상에 생체 분자의 코팅 또는 세포의 성장 중 하나에 의해 모델링된다hamber 3. 입자 4-7 또는 8-16 세포는 다양한 전단 속도에 따라 입자를 부착의 수를 계량하는 유량의 원하는 범위에 유입된다.

그러나, 생화학 적 현상을 연구하고 검증하는 평행 평판 유동 챔버의 사용은 약간 고가이며 시간 소모적이다. 이것은 여러 실험 부착 입자 / 세포의 수 대 유체 전단의지도를 생성하기 위해 수행 될 필요가 있다는 사실에 주로 기인한다. 또한, 플레이트 흐름 챔버는 그들의 큰 크기 (높이> 250 μm의 폭> 1mm)에 시약의 많은 양을 필요로한다. 마지막으로, 이러한 장치는 정확하게 생체에 존재하는 기하학적 특징 (예를 들면, 분기점) 및 유동 조건 (예를 들어, 흐름을 발산 대 수렴)를 모델링하지 않습니다.

리소그래피 기반 미세 17-19 최근 진보는 랩 온어 칩의 필드를 가속화장치 20-21. 이러한 장치는 마이크로 미터 정권의 차원과 병렬 플레이트 흐름 챔버의 소형 버전을 개발하는 수단이되고있다. 치수의 감소는 또한 시약, 세포 나 실험에 필요한 입자의 양 측면에서 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 그러나, 현재 사용 가능한 장치의 주요 제한은 생체 내에서 관찰 복잡한 미세 혈관을 모방하지 않는 미세 혈관을 모델링하는 선형 채널의 사용이다.

우리는 최근 생체 조건의 합성 표현의 결과로 처분 할 수있는 플라스틱 기판에 미세 혈관 네트워크를 재현하기위한 새로운 방법을 개발했습니다. 이 장치는 SynVivo 합성 미세 혈관 네트워크 (SMN)이 소프트 리소그래피 공정을 기반 PDMS를 사용하여 개발 불린다. SynVivo-SMN 장치가 셀 / 파티클 부착 (22)의 전단 접착력 맵을 얻기 위해 사용될 수 있으며, 연구는 약물 전달 (23)과 H를 타겟팅생체 데이터를 24 ~ 25에 대해 유효성이 확인 된 번가. 이 논문에서, 우리는 1 ~ 5 ㎕를가함으로써 자원과 시간을 크게 절감의 결과로 작은 볼륨에서 하나의 실험에서 전단 접착지도의 생성을 가능하게하는 프로토콜을 제시한다.

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프로토콜

1. 못쓰게 SynVivo - SMN 미세 유체 장치

  1. 장치의 각 포트 (입구 / 출구)는 두 개의 병렬 포트로 구성되어 있습니다 - 표면 코팅 부분에 흐르는 하나의 (부착 분자, 성장 행렬 등) 및 / 또는 파종 및 분석 (그림 1A를 실행하는 기타 세포 ).
  2. 완전 멸균 탈 (DI) 물을 포함하는 페트리 접시에 SynVivo - SMN 마이크로 유체 장치 (그림 1B)를 물속에 진공 데시 케이 터에 접시를 놓습니다. 모든 공기는 장치의 채널에서 제거 될 때까지 건조기가 실행될. 이것은 약 15 분 소요됩니다.
  3. 물에서 장치를 제거하기 전에, 미세 포인트 집게로 장치의 각 포트에 물을 준비하는 타이곤 튜브 (0.06 OD "0.02의 ID")를 배치합니다. 튜브의 길이는 약 1 인치이어야한다. 이 디바이스는 이제 물에서 제거 할 수 있습니다. 그림 1C는 배포 장치의 이미지를 보여줍니다튜브에 전자.

2. 원하는 단백질과 미세 유체 장치를 코팅 (예를 들어, 아비딘)

  1. 피펫을 사용하여, 하나의 흡입구 튜브의 기지 주변의 물 (약 100 μL)의 하락을 배치합니다. 조심스럽게 주요 장치에 사용되는 튜브를 제거합니다. 물방울은 장치에 들어가는 공기를 방지 할 것이다.
  2. 20 ㎍ / ㎖의 농도에서 아비딘로드 1 ML의 주사기를 준비합니다. 24 G 스테인레스 스틸 바늘과 튜브에 주사기를 연결합니다. 장치의 입구 포트 중 하나에 튜브를 삽입한다. 턱 클램프로 활용되고 있지 유입구 클램프.
  3. 장치의 완전한 재관류를 허용하도록 10 분 동안 1 μL / 분의 유속으로 주입 아비딘. 유동 시간의 끝에서, 턱 클램프 튜브 클램프하고 밤새 39 ° C에서 장치를 배치.

3. 접착 실험에 대한 바이오틴 입자를 흐르는

  1. 장치에 허용실온에 와서. 동력 스테이지 및 고성능 카메라를 구비 한 반전 된 형광 현미경에 기기를 배치.
  2. 인산 완충액 생리 식염수 (PBS) 중 5 × 106 입자 / ml의 농도로 2 μM 바이오틴 입자의 용액을 제조 하였다. 1 ML의 주사기로 입자를 넣습니다. 만 PBS의 제 1 ML의 주사기를 준비합니다. 주사기 펌프 각 주사기를 넣고 바늘과 튜브에 연결합니다.
  3. 피펫을 사용하여 흡입구 튜브의 기지 주변의 물 (약 100 μL)의 하락을 배치합니다. 조심스럽게 코트 장치에 사용되는 튜브를 제거합니다. 물방울은 장치에 들어가는 공기를 방지 할 것이다.
  4. 조심스럽게 입구 포트에 각각 단계 3.2 바이오틴 입자와 PBS에 대한 튜브의 삽입합니다. 그림 2A는 셋업의 이미지를 보여줍니다.
  5. 2.5 μL / 분의 유속으로 바이오틴 화 입자를 주입하기 시작한다. 현미경의 유입 포트를 모니터링합니다. 첫 번째 기호입자, 타이머를 시작하고 3 분 동안 흐름을 계속합니다.
  6. 동시에 2.5 μL / 분의 유속으로 PBS의 흐름을 응시하면서 3 분의 끝에서, 바이오틴 화 입자의 흐름을 멈춘다. PBS는 언 바운드 입자를 씻어 3 분의 장치에 흐름을 허용합니다.

4. 이미지 획득 및 이미징 소프트웨어 (NIKON 요소)를 사용하여이자 (AOI) 측정의 지역 만들기

  1. 전체 장치의 이미지를 얻기 위해 이미징 소프트웨어의 "스캔 큰 이미지"기능을 사용합니다.
  2. 장치에 순차적으로 번호 분기점과 채널의 두 배 직경 원형 AOI를 만듭니다. 채널 직경 100 μm의 때문에이 경우에는 200 ㎛로 AOI 직경을 설정한다.
  3. MS 엑셀 시트에 각 AOI에있는 입자의 수​​를 내보낼 이미징 소프트웨어의 자동 카운트 기능을 사용합니다.
  4. 마찬가지로, 전체 입자의 수​​를 내보낼 자동 카운트 기능을 사용장치.

5. 전산 유체 역학 (CFD) 모델을 사용하여 입자 플럭스 분석

  1. CFD 시뮬레이션은 SynVivo - SMN 장치 토폴로지를위한 상용 소프트웨어 (CFD-ACE +, ESI 주식 회사)를 사용하여 실행됩니다. 결과는 실험적 관측을 분석 데이터베이스에 저장된다. 벽 전단 속도, 속도, 입자 플럭스, 장치의 부착에 대한 시뮬레이션 결과 정보를 저장합니다.
  2. 시뮬레이션 결과는 관련 입구 입자 농도에 기초하여 각각의 AOI 들어가는 입자의 개수를 결정하는 데 사용된다.

6. 생성 전단 접착지도

  1. 수학 식 6.1에 도시 된 바와 같이 분기점에서 흐르는 입자로의 분기점에 부착 된 입자를 분할함으로써 밀착성의 %를 계산한다.
    figure-protocol-2571
    부착 입자 흐르는 입자의 수​​는 P로부터 획득되는 곳rotocol은 각각 4.3과 5.2 단계를 반복합니다.
  2. 단계 (5.1)에서의 데이터베이스로부터 얻어진 네트워크 및 수학 식 6.1로부터 얻어진 % 접착 값의 각 분기점에서 전단 속도를 사용하여 전단 접착지도를 플롯.

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결과

도 1a는 SynVivo-SMN 장치의 회로도 및 시야 화상을 나타낸다.도 1b는 유리 슬라이드 상에 장착 SynVivo-SMN 장치.도 1C는 진공 데시 케이 터에 물 프라이밍 다음 튜빙 장치를 도시 나타낸다.

그림 2A는 2 μm의 바이오틴 입자의 결합 다음과 같은 일반적인 아비딘 코팅 SynVivo - SMN 장치를 보여주는 실험 세트입니다. 그림 2B의...

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토론

병렬 플레이트 흐름 챔버, 세포 - 세포 및 세포 입자의 상호 작용에 중요한 통찰력을 제공하는 동안, 이러한 높은 시약의 소비와 전단 접착 맵을 생성하기 위해 여러 실험을 실행에 대한 필요성과 같은 몇 가지 제한으로 고통. SynVivo 합성 미세 혈관 네트워크 (SynVivo-SMNs)의 사용은 생체 내 조건에서 모방 조건 번의 실험에서 전단 접착 맵의 생성을 가능하게한다. 또한, 시약의 상당한 절감 (>...

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공개

CFD 연구 법인의 후원이 기사에 대한 게재료.

감사의 말

SynVivo 기술은 NHLBI에서 부여 # 2R44HL076034에서 개발되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
SynVivo-SMNCFD ResearchSMN-001Exclusive at CFDRC
CFD-ACE+ESI Inc.N/A
AvidinInvitrogen43-4401Any avidin source will work for this assay
Biotinylated ParticlesPolysciences24173-1Any source of biotinylated particles will work for the assay
Tygon TubingVWR63018-044Size is typical for use with SynVivo-SMN
NIKON ElementsNIKON InstrumentsN/AAny other imaging software can be used

참고문헌

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