성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

요약

우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.

초록

무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 머리 외상의 가장 일반적인 형태, 이는 단절의 범위에 걸쳐 복잡 하 고 이종이 불 쌍이 이차 효과 결과. 인간에서 TBI다음 잃어버린 뉴런을 대체하거나 재생하는 메커니즘은 없지만, 제브라피쉬는 뇌를 포함하여 몸 전체에 뉴런을 재생하는 능력을 가지고 있습니다. 무딘 힘 TBI다음 얼룩말 피시에 전시 된 병리학의 폭을 검사하고 후속 뉴런 재생 반응의 기초 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 성인 얼룩말 피시에 사용하기 위해 일반적으로 사용되는 설치류 Marmarou 체중 방울을 수정했습니다. 우리의 간단한 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 그리고 접촉 과 외상 후 발작, 부종, 경막 및 추적 혈종 혈종, 인지 장애등 인간의 TBI 다음 관찰 표현형의 많은 재구성, 각각 부상 심각도 의존적 인 방식으로 표시. 부상 후 몇 분 이내에 나타나기 시작하는 TBI 후유한은 부상 후 7 일 이내에 거의 손상되지 않은 제어 수준으로 돌아갑니다. 재생 과정은 부상 후 48시간(hpi)부터 시작하며, 최고 세포 증식은 60마치에 의해 관찰됩니다. 따라서, 우리의 zebrafish 무딘 힘 TBI 모형은 제브라피시에 유일하게 신경 재생의 기계장치와 더불어 질병 개시 및 진행을 조사할 수 있는 인간 TBI와 유사한 특징적인 1 차 및 이차 상해 TBI 병리를 생성합니다.

서문

외상성 뇌 손상 (TbIs)은 글로벌 건강 위기와 사망과 장애의 주요 원인입니다. 미국에서는 매년 약 290만 명이 TBI를 경험하고, 2006-2014년 사이에 TBI 또는 TBI 후유로 인한 사망률은 50%¹ 이상 증가했습니다. 그러나, 결핵은 그들의 병인학, 병리학 및 임상 프리젠 테이션에서 주로 상해의 기계장치에 부분적으로 기인합니다 (MOI), 이는 또한 처리 전략 및 예측 예후²에 영향을 미칩니다. 비록 결핵은 다양 한 MOI에서 발생할 수 있습니다., 그들은 주로 관통 또는 무딘 힘 외상의 결과. 관통 외상은 결핵의 작은 비율을 나타내고 즉각적이고 주변 찔린 뇌 부위에 국한되는 심각하고 초점 상해를 생성³. 대조적으로, 무딘 힘 TBI는 일반 인구에서 일반적입니다, 단절의 범위에 걸쳐 (온화한, 보통, 심한), 여러 뇌 영역에 영향을 미치는 확산, 이질성, 글로벌 상해^{를 생산1,4,5}.

Zebrafish (Danio rerio)는 중추 신경계 (CNS)^6,7,8,9에 걸친 광범위한 신경 학적 모욕을 검사하는 데 활용되었습니다. Zebrafish는 또한 포유류와 달리 CNS 손상을 복구하기 위한 선천적이고 강력한 재생 반응을 가지고 있습니다¹⁰. 현재 zebrafish 외상 모델은 침투, 절제, 화학 적 모욕 또는 압력 파동을 포함한 다양한 부상 방법을 사용합니다11,12,13,14,15,16. 그러나, 이들 각각의 방법은 거의 인간 인구에 의해 경험되지 않는 MOI를 활용, 부상 단절의 범위에 걸쳐 확장 할 수 없습니다, 무딘 힘 TBI 후보고 이질성 또는 심각도 의존 TBI 후이를 해결하지 않습니다. 이러한 요인은 인간 인구에서 TBI의 일반적인 형태와 관련된 병리학의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 제브라피시 모델의 사용을 제한 (가벼운 무딘 힘 부상).

우리는 상해 병리학, TBI 후유증의 진행 및 타고난 재생 반응을 조사할 수 있는 방법을 제공하는 신속하고 확장 가능한 무딘 힘 TBI 제브라피시 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 일반적으로 사용되는 설치류 ^Marmarou17 체중 방울을 수정하고 성인 얼룩말 물고기에 적용했습니다. 이 모델은 온화하고 중간정도에서 중증에 이르는 다양한 절단 범위를 산출합니다. 이 모델은 또한 발작, 부종, 경막 및 추적 혈종, 신경 세포 죽음 및 학습 및 기억 장애와 같은 인지 적자를 포함하여 심각도 의존적 방식으로 인간 TBI 병리학의 여러 측면을 재구성합니다. 부상 후 며칠, 병리학 및 적자가 사라지고 손상되지 않은 컨트롤과 유사한 수준으로 돌아갑니다. 추가적으로, 이 제브라피쉬 모형은 상해 엄격에 관하여 신경축에 걸쳐 강력한 증식 및 신경 재생 반응을 표시합니다.

여기에서는 무딘 힘 외상의 설정 및 유도, 외상 후 발작 점수, 혈관 부상 평가, 뇌 섹션 준비 지침, 부종 정량화 에 대한 접근 및 부상 후 의 확산 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

브라위피쉬는 프레이만 생명과학 센터의 노틀담 제브라피시 시설에서 자랐으며 유지되었습니다. 이 원고에 설명 된 방법은 노틀담 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다.

1. 외상성 뇌 손상 패러다임

1. 시스템 물 1L에 2-페녹시에탄올 1mL를 추가하십시오(1L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg).
2. 실온에서 2L의 시스템 물을 포함하는 배수 복구 탱크를 준비합니다.
3. 원하는 볼 베어링 무게와 강철/플라스틱 튜브의 원하는 길이 와 직경을 선택하고 에너지와 충격력을 결정합니다.
   참고: 튜브는 경로 나 이동 속도를 변경하지 않고 볼 베어링이 통과 할 수있는 내부 직경을 가져야합니다.
   1. 충격에 따라 운동 에너지를 결정합니다.
      
      여기서, KE = 운동 에너지, m = 질량(kg), g = 중력, h = 높이(m)가 드롭포인트에서 물고기까지.
      참고: J. J. 에서 운동 에너지를 1,000으로 곱하여 mJ를 결정합니다. KE 는 볼 베어링이 고정 된 위치에서 떨어질 때 발생하는 가속 물체를 기반으로합니다.
   2. 얼룩말 두개골 (총 거리 9.1cm)과 1.5g (6.4mm 직경) 볼 베어링의 플레이트 위 1.5cm를 끝내는 7.62cm 길이의 강철 / 플라스틱 튜브를 사용하여 온화한 TBI (miTBI)를 생성합니다. 이들은 1.33 mJ의 운동 에너지를 생성합니다. 이 손상은 경험적으로 혈관 상해, 경막막/무산혈 혈종 형성, 신경 세포 죽음 및 심각도 의존적인 방식으로 인간 인구에서 보고된 것을 크게 회수하는 인식 손상과 같은 주요 병리학TBI 마커에 근거를 둔 miTBI에 해당하기로 결정되었습니다.
   3. 운동 에너지 miTBI 계산 =
   4. 제브라피쉬 두개골(총 거리 14.2cm)과 2.08mJ의 운동 에너지를 생성하는 1.5g(직경 6.4mm) 볼 베어링의 플레이트 위로 1.5cm 를 끝내는 12.7cm 길이의 강철/플라스틱 튜브를 사용하여 적당한 TBI(moTBI)를 생성합니다.
   5. 운동 에너지 moTBI 계산 =
   6. 7.62cm 길이의 강철/플라스틱 튜브를 사용하여 심한 TBI(sTBI)를 생성하여 제브라피쉬 두개골(총 거리 9.1cm)과 3.3g(직경 8.38mm) 볼 베어링의 플레이트 위로 1.5cm 를 종료하여 2.94mJ의 운동 에너지를 생성합니다.
   7. 운동 에너지 sTBI 계산 =
4. 페트리 접시에 모델링 점토(도 1, 1단계)를 채우고 무딘 악기(즉, 집게 의 뒷면)를 사용하여 추가 모델링 점토(그림 1, 2단계)가 있는 제기 플랫폼(5cm x 1.5cm)을 만듭니다.
   1. 면도날을 사용하여 제기된 플랫폼을 대략 2개의 동일한 반으로 세로로 나눕니다(그림 1, 3단계, 빨간색 파선). 두 반쪽을 성인 물고기의 길이를 수용 하는 채널로 형성 (그림 1, 단계 4). 추가 점토를 사용하여 물고기 몸의 ~ 2/3을 고정하여 머리를 노출시키는 벽을 구축하십시오.
   2. 부상 시 헤드의 회전이나 반동을 피하기 위해 헤드를 지지하기 위해 벽에 수직으로 노출된 헤드 부위에 작은 지지체를 성형한다(도 1, 4단계).
      참고: 채널은 등쪽에서 물고기를 지원할 만큼 깊어야 하지만 여전히 머리가 주변 점토 위에 안주하도록 해야 합니다. 또한, 머리 지원은 낮은 하악골과 아가미를 지원하는 물고기의 자연적인 곡률을 따라야한다.
   3. 떨어뜨린 중량이 채널의 측면에 의해 방해되지 않았는지 확인합니다(그림 1, 4단계).
5. 미니 홀 펀치와 22g 스틸 깜박임으로 직경 3mm의 강철 디스크를 만듭니다. 각 디스크는 여러 번 사용될 수 있습니다.
6. 1:1000(1mL/1 L, 0.1%) 2-페녹시에탄올이 꼬리 꼬집기까지 50-100mL의 비커에 배치하여 한 마리의 물고기를 마취시킵니다.
7. 물고기, 등쪽 을 위로 배치, 몸이 측면에 고정되도록 채널 내의 점토 금형에 원하는 충격 점을 중심으로 머리에 3mm 22g 강철 디스크를 배치 (도 1, 단계 5).
   1. 물고기가 머리를 한쪽으로 기울지 않도록 가능한 한 수직으로 정렬되어 고르지 못한 영향을 줄 수 있습니다.
8. 표준 링 스탠드와 암 클램프를 사용하여 강철/플라스틱 튜브를 고정하므로 튜브의 바닥은 제브라피시의 머리 위로 1.5cm 입니다(그림 1, 6단계). 튜브가 직선인지 확인하십시오.
   1. 튜브를 내려다보고 튜브가 강판 위에 정렬되었는지 확인합니다.
9. 볼 베어링(경미하고 중간 정도의 TBI의 경우 1.5g, 중증 TBI의 경우 3.3g)를 소정의 높이(1.3.3-1.3.5단계설명)에서 원하는 신경해부학 적 영역 위에 위치한 강판에 튜브를 내려 놓아 원하는 신경해부학적 영역(예를 들어, 소뇌, 도 1, 5 단계 5)을 원하는 중증도에 대한 무딘 TBI 의 중증도를 생성한다. 부상당한 물고기를 복구 탱크에 배치하여 모니터링합니다.
   참고: 부상의 심각도에 따라 사망률 또는 토닉 클로닉 발작이 발생할 수 있습니다. 물고기가 TBI 다음 시간의 장시간 동안 응답하지 않는 경우, 꼬리 핀치를 관리하고 통증 반응을 평가하기 위해 전송 파이펫 이나 집게를 사용합니다.

2. 성인 얼룩말피에서 TBI 후 발작 점수

1. 섹션 1에 설명된 부상 프로토콜에 따라 물고기를 마취하고 다치게하고 부상당한 물고기를 시스템 물 2 L의 배수 복구 탱크에 놓습니다.
2. 복구 탱크에 배치 된 직후시작 외상 후 발작의 흔적에 대한 물고기를 관찰. 관찰 시간(즉, 1h)을 설정하고 발작 점수(아래에 설명됨), 각 발작 의 지속 시간 및 발작을 경험한 물고기의 백분율을 포함한 모든 발작 활동을 기록합니다(그림 2A).
   참고: 발작은 부상 시 즉시 발생할 수 있으며, TBI 이후의 시간 또는 일도 발생할 수 있습니다. 발작은 장기적으로 지속될 수 있고 단 하나 물고기는 다중 발작이 있을 수 있습니다. 1 시간 이상 관측 시간을 설정하면 발작 률의 전반적인 추세를 잘 나타낼 수 있습니다.
3. 성인 얼룩말 물고기 발작 표현형에 대한 Mussulini18 지침을 사용하여 물고기 점수.
   참고: 추적 소프트웨어를 사용하지 않고는 발작 점수를 3 미만으로 평가하기가 어렵습니다. 따라서 소프트웨어 없이 평가가 수행될 때 3개 이상 발작 점수만 기록해야 합니다.

3. 뇌 해부

1. 아가미 운동이 중단될 때까지 2-페녹시에탄올의 1:500(2mL/1 L, 0.2%) 용액으로 물고기를 안락사시키고 원하는 엔드포인트에서 핀 핀치에 반응하지 않습니다.
2. 페트리 접시에 모델링 점토를 채우고 해부 중에 몸을 지탱할 수 있는 작은 캐비티를 만듭니다.
3. 물고기, 등쪽을 점토 몰드에 올려 놓습니다. 물고기의 몸체 중간에 중간선을 통해 해부 핀 1개를 놓고 머리 의 밑면 뒤에 두 번째 핀 ~5mm를 놓습니다.
4. 해부하는 빛 현미경에서, 무뚝뚝하게 #5 Dumont 집게의 쌍으로 시신경을 끊고 눈을 제거합니다 (그림 2A).
5. 현미경을 통해 볼 때 장편 끝이 가장 멀리 되도록 물고기를 지향 (그림 2B).
   참고: 다음 단계는 오른손잡이 개인을 위한 것입니다. 왼손잡이 개인은 미러 방향으로 다음 단계를 수행하는 것을 선호할 수 있습니다.
6. #5 집게를 사용하여 집안판의 한쪽 끝을 천천히 배치하여 고의적인 가위 동작이 로스트랄 끝으로 이동하고 오른쪽 정수리 및 정면 플레이트(그림 2C)를 제거합니다.
   1. 해부 동안 뇌를 관통하지 않도록 집게를 45° 이하의 각도로 유지하십시오.
7. 물고기를 시계 방향으로 90° 회전시. 왼쪽 정수리 플레이트 아래에 #5 집게의 한쪽 끝을 놓고 동일한 가위 동작을 사용하여 뇌의 전체 등쪽 측면을 노출하는 왼쪽 정수리 및 전두엽 판을 제거합니다(그림 2D, E).
8. #5 포셉으로 맥실라를 무뚝뚝하게 변형시합니다. 후각 전구를 보존하고 관심 영역인 경우 손상되지 않습니다.
9. #5 포셉(그림 2F)으로 오른쪽 오퍼클, 프리오퍼클, 인터로퍼클 및 서브퍼클을 제거합니다.
10. #5 포셉을 사용하여 칼바륨 개구부의 caudal 끝에 있는 근육을 무뚝뚝하게 절제하여 척수를 노출시십시오.
11. #5 포셉으로 척수를 무뚝뚝하게 변질합니다. 조심스럽게 뇌 아래에 집게를 배치하고 부드럽게 칼바륨에서 뇌를 제거합니다.
    참고 : 뇌를 꼬집어하지 마십시오. 집게를 사용하여 뇌를 "요람"하거나 caudally 절제하고 노출된 척수를 뇌를 기동하는 핀치 포인트로 활용하십시오.
12. 로커 플랫폼에서 4°C에서 하룻밤 사이에 9부 100% 에탄올에서 1부 37% 포름알데히드로 제거된 뇌를 수정합니다.

4. 제브라피쉬 뇌에 대한 부종 연구

1. 섹션 1에 설명된 부상 프로토콜에 따라 물고기를 마취하고 다치게하고 물고기가 자유롭게 수영을 시작할 때까지 복구 탱크에서 회복 할 수 있도록합니다.
2. 1 일 동안 정상적인 주택 조건에 다시 물고기를 배치합니다.
3. 시간이 경과 한 후, 1:500 2-페녹시에탄올에서 물고기를 안락사.
4. 섹션 3에 설명된 프로토콜에 따라 전체 뇌 또는 관심 영역을 해부하고 뇌를 작은 계량 보트에 즉시 배치합니다.
   참고: 두뇌를 옮길 때주의를 기울여야 하며, 미세한 집게를 사용하여 뇌를 찌르거나 긁지 않고 계량 보트에 부드럽게 배치하여 조직의 손실을 초래할 수 있습니다.
5. 라벨 (부상 그룹과 뇌 수) 및 규모에 추가 작은 건조 계량 보트를 타고. 정확한 측정을 위해 최소 0.001g을 측정할 수 있는 스케일을 사용합니다.
6. 타르 건조 계량 보트에 뇌를 전송하고 뇌의 젖은 무게를 기록합니다. 그들은 등쪽 측이 위를 향하고 무게 보트에 평평하게 누워 있도록 뇌를 오리엔팅.
7. 건조 계량 보트와 뇌를 혼성화 오븐에 넣고 8시간 동안 60°C로 설정합니다.
8. 건조 후, 뇌는 건조 계량 보트에 충실 할 수 있으며 제거하고 새로운 타르 작은 무게 보트로 전송하기 어려울 수 있습니다. 이 건조 한 두뇌에 손상 및 조직의 손실 귀 착될 수 있습니다, 집게와 두뇌를 꼬집어 하지 마십시오. 대신, 미세 한 집게를 함께 꼬집어, 뇌의 복부 측면에서 시작, 위쪽으로 움직임에 국자.
9. 수식을 사용하여 각 뇌의 수분 함량을 결정합니다(그림 4):
   

5. 신경축을 가로 질러 세포 증식을 표시하고 고정 된 조직을 준비.

1. _ddH2O 의 2mL에서 10mM 5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU)을 준비한다.
2. 1:1000mL(1mL/1 L, 0.1%) 2-페녹시에탄올에서 한 번에 3~4마리의 물고기를 마취하여 물고기가 꼬리 꼬집어 반응하지 않을 때까지(섹션 1에 설명된 프로토콜 사용).
3. 젖은 스폰지에 부분 절개를하고 개구부, 복부 측면에 한 번에 하나의 물고기를 배치합니다.
4. 30G 바늘을 사용하여 10mM EdU의 ~40 μL을 물고기의 몸에 주입하십시오. 물고기는 시스템 물로 채워진 지주 탱크로 돌아갑니다.
   참고: 반복 주사는 다른 시점에서 수행될 수 있고 증식 세포의 더 많은 수를 레이블을 지정하고 1 주 이상의 추적 기간이 원하는 경우 필요할 수 있습니다.
5. 섹션 3에 설명된 대로 뇌를 수집하고 9부 100% 에탄올의 2mL를 포함하는 5mL 유리 바이알에 1부 37% 포름알데히드로 배치한다. 로커 플랫폼에서 4°C에서 뇌를 수정합니다.
   참고: 로커 또는 셰이커 플랫폼은 뇌가 바닥에 쉬고 전체 뇌의 텔렌스팔론이 컬링되는 것을 금지합니다.
6. 뇌를 고치는 데 사용되는 유리 유리 바이알에서, 내림차순 에탄올 시리즈의 세척, 75%, 50%, 25%, 각각 15분, 실온에서 로커에 5%의 자당/PBS로 1.5h 세척이 뒤따랐다. 로커 플랫폼에 4° C에서 30% 자당/PBS에 밤새 유리 유리 병에 두뇌를 저장합니다.
7. 30% 자당/PBS에서 뇌를 제거하고 12웰 플레이트(웰당 1개의 치료그룹)로 이송하고, 2부조직 동결배지와 1부 30%의 자당/PBS로 구성된 2:1 용액으로 채워진 웰을 이체한다. 로커 플랫폼에서 4°C에서 하룻밤 동안 뇌를 배양합니다.
8. 4°C에서 2-24h에 대해 100% TFM에서 12웰 플레이트 내의 다음 웰행으로 뇌를 옮기는다.
9. 냉동 척을 사용하여 TFM에 뇌를 건조 얼음의 원하는 방향으로 포함시킵니다.
10. 저온 절제 (16 μm 두께 의 섹션)를 수행하고 양전하 슬라이드의 섹션을 수집합니다. 1 시간 동안 슬라이드 워머에 건조 슬라이드 다음 -80 ° C에 저장하거나 면역 작용으로 계속.
11. 조직 섹션 주위 슬라이드에 소수성 장벽을 준비하고 20 분 동안 슬라이드 워머에 건조 할 수 있습니다.
12. PBS에서 슬라이드를 5분 간 간 간략하게 씻어낸 다음 PBS-Tween 20(0.05%)에서 각각 10분 동안 두 번 세척합니다.
13. EdU 세포 증식 키트 및 제조업체의 지침을 사용하여 EdU 탐지를 수행합니다.
14. 슬라이드를 분석하고 형광 EdU 표지 된 세포를 상피 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 정량화합니다. 개별 셀을 명확하게 구분하려면 최소 40배의 목표가 필요합니다.

결과

부상 유도 장비를 준비하면 성인 얼룩말물고기에 확장 가능한 무딘 힘 TBI를 제공하는 빠르고 단순한 수단을 사용할 수 있습니다. 부상 모델의 등급 심각도는 혈관 부상이 가장 쉽고 눈에 띄는 병리학 중 하나이지만 성공적인 부상의 몇 가지 쉽게 식별 할 수있는 메트릭을 제공합니다 (그림 3). 부상 중에 사용되는 물고기의 변형은이 지표를 쉽게 또는 식별하기 어렵게 만들 ?...

토론

신경 외상 및 관련 후유증에 대한 조사는 오랫동안 기존의 비 재생 설치류 모델에 중점을 두어 왔습니다²⁰. 최근에는 ^{재생 모델에 다양한} 형태의 CNS 손상을 적용한 연구9,11,13,14,21. 통찰력이 있지만, 이러한 모델은 인간 인구에서 흔히 볼 수 없는 부상 방법(?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-phenoxyethanol	Sigma Alderich	77699
#00 buckshot	Remington	RMS23770	3.3g weight for sTBI
#3 buckshot	Remington	RMS23776	1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps	WPI	14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine	Life Technologies	A10044	EdU
5ml glass vial	VWR	66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C10340
CytoOne 12-well plate	USA Scientific	CC7682-7512
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Super frost postiviely charged slides	VWR	48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker	Ted Pella	22309
Tissue freezing medium	VWR	15148-031