커피 베리 보어 hypothenemus hampei에 대한 통제제 및 살충제를 테스트하는 방법론

요약

그린 커피 과일 (GF)을 사용하는 방법은 커피 베리 보러 (CBB)에 대한 살충제의 독성을 테스트하기 위해 개발되었습니다. 살충제 또는 독성 물질은 CBB 감염 전후에 소독 된 GF에 적용되었습니다. 곤충 사망률, 기피성 및 생식 능력은 다른 매개 변수 외에도 평가되었습니다.

초록

커피 베리 보러 (CBB) Hypothenemus hampei를 치료하기 위해 살충제를 권장하기 전에 성인 곤충에 대한 이러한 살충제의 사망률과 혐오감 또는 생식 출력에 미치는 영향을 아는 것이 중요합니다. 그러나 현재 이용 가능한 방법은 성인 사망률만을 평가하여 다른 행동 방식을 가진 새로운 살충제의 선택을 제한합니다. 이 연구에서는 실험실 조건에서 CBB에 대한 다양한 효과를 확인하기 위해 다양한 실험 방법을 조사했습니다. 이를 위해 그린 커피 과일(GFs)을 수집하고 차아염소산나트륨 용액에 침지한 후 자외선을 조사하여 소독하였다. 병행하여, 콜로니로부터의 CBB 성인은 차아염소산나트륨 용액에 침지함으로써 소독되었다. 과일 보호 (preinfestation)를 평가하기 위해 과일을 플라스틱 상자에 넣고 살충제를 적용했습니다. 이어서, CBB 성인을 GF 당 두 개의 CBB의 비율로 방출하였다. GFs를 1, 7, 15 및 21일 후에 CBB 감염 및 생존을 평가하기 위해 조절된 조건 하에 방치하였다. CBB 감염 후(postinfestation) 후 살충제 효능을 평가하기 위해, CBB 성인은 21°C에서 3시간 동안 2:1 비율로 GFs를 방출하였다. 복부가 부분적으로 노출 된 CBB 성인을 보여주는 감염된 과일을 선택하여 96 웰 랙에 넣고 과일에 지루한 CBB를 직접 처리했습니다. 20 일 후, 과일을 해부하고, 각 과일 내부의 CBB 생물학적 단계를 기록하였다. GF는 CBB에 대한 독성, 화학 및 생물학적 살충제를 평가하기 위해 자연 조건을 모방하는 기질 역할을했습니다.

서문

커피 베리 보러 (CBB), Hypothenemus hampei는 콜롬비아에서 1988 년에 처음 발견되었으며 이후 커피 작물의 가장 중요한 해충 종이되었습니다. CBB 암컷은 출생 과일을 이미 수정 된 상태로 남겨두고 ^1,2에서 방출하는 휘발성 화학 물질에 의해 인도 된 새로운 과일을 찾습니다. 완전한 사이클은 25°C의 온도에서^23일3일 이내에 성취된다. 주기는 창시자 여성이 씨앗을 관통하고 과일 내정자에 알을 낳는 것으로 시작됩니다. eclosed 애벌레는 씨앗을 먹습니다. 이 시점에서 과일이 해부되면 창립자 여성과 자손을 모두 관찰 할 수 있습니다. 14 일 후, 애벌레는 번데기가되고, 번데기 단계는 5 일간 지속됩니다. 성인 단계에서 암컷은 형제 자매들과 교배하고, 새로 수정 된 암컷은 손상된 과일에서 날아 다니며 새로운 커피 과일을 찾아 새로운 사이클⁴를 시작합니다.

침투 과정과 애벌레 먹이의 결과 모두 커피 씨앗을 손상시켜 커피 음료의 품질을 떨어 뜨리고 수익을 크게 줄입니다. 커피 농장에서 5 % 이상의 감염은 일반적으로 경제적 한계점으로 간주됩니다.

CBB 방제는 문화적 통제 및 농경 관행, 천연 생물학적 제제 및 화학 살충제의 사용을 포함한 통합 해충 관리 (IPM) 전략을 기반으로하며, 이는 안전 조건과시기 적절한 적용이 필요합니다⁴.

CBB의 통제를위한 새로운 살충제를 평가하기 위해서는 신속한 결과를 얻을 수있는 저렴한 방법론이 필요합니다. 실험실 및 현장 절차 모두 살충제가 통합 된 커피 를 함유 한 인공 식단^5,6 또는 건조 양피지 커피 7,8,9에 살충제를 분무하는 것을 포함하여 현재 사용되고 있습니다. 또한, 곤충학적 슬리브로 덮인 커피 나뭇가지를 사용하여 현장에서 수행된 실험은^10,11; 그러나 이러한 방법은 강렬한 노동과 긴 평가 기간이 필요합니다.

자연 필드 조건과 유사한 조건, 즉 빠르고 저렴한 조건은 녹색 또는 잘 익은 커피 과일을 사용하는 것입니다. 그러나 이러한 과일은 CBB 개발에 적합한 조건에서 유지되어야하며, 품질과 특성을 유지하기 위해 미생물에 의한 변화와 오염 물질을 피해야합니다. 이를 위해 다양한 소독제 뿐만 아니라 열 및 방사선 7,9,12,13,14,15,16과 관련된 절차가 사용되었습니다.

또한 CBB에 대한 살충제 평가 방법은 과일을 찾아 날아 다니거나 과일을 관통하는 성인 여성의 시뮬레이션을 필요로합니다^17,18. 이를 위해 8,11,19^{현장에서 인공} 과일 침입이 수행되었지만이 과정은 노동 집약적이며 환경 조건에 달려 있습니다.

여기에서는 현장 조건과 유사한 통제 된 환경 조건 하에서 CBB에 다른 영향을 줄 수있는 제품의 평가를위한 표준화 된 방법론을 설명합니다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜은 실험실 조건에서 CBB에 대한 다양한 효과를 식별하는 다양한 방법을 다룹니다.

1. 과일 수집

1. 아침 일찍 커피 농장에서 나무에서 개화 한 후 ~ 120-150 일의 발달 연령을 가진 GF를 선택하십시오.

2. 과일 소독²⁰

1. 약 300 GF를 실험실로 가져 오십시오. 균일 한 크기와 건강한 GF를 선택하고 peduncles를 철회하십시오.
2. GFs를 비누 용액 (998 mL의 수돗물에 2 mL의 액체 식기 세척 비누)에 담근 다음 GF를 문질러 GF를 세척하십시오. 그런 다음 과일을 물로 헹구고 물을 세 번 바꿉니다.
3. GFs를 0.5% 차아염소산나트륨 용액(수돗물 900mL에 100mL)에 담그고 110rpm으로 진탕기에서 15분 동안 교반한다. 그런 다음, GFs를 진탕기에서 교반하고 10분마다 물을 세 번 변화시켜 물로 헹구십시오.
4. 멸균 종이 타월로 GF를 말리십시오.
5. GF를 트레이(33cm x 25cm x 2cm)에 놓고 15분 동안 조사한 다음 GF를 UV 소스에서 55cm 떨어진 곳에 배치하여 UV가 활성화된 수평 층류 스테이션 내부에 배치합니다.
6. 15 분 동안 5 분마다 GF를 움직여 전체 과일의 조사를 보장합니다.

3. 곤충 소독²¹

1. 새로 출현 한 (당일) CBB 곤충을 사용하여 생물 분석을 설정하십시오.
2. CBB를 0.5 % 차아 염소산 나트륨 용액에 담그고 브러시로 천천히 10 분 동안 교반하십시오.
3. CBB를 무슬린 천으로 여과하고 멸균 증류수로 세 번 씻으십시오.
4. 멸균 종이 타월로 과도한 물을 제거하십시오.

4. 과일에 대한 보호 효과가 있는 제품의 평가(감염 전)(그림 1)

1. 실험 단위당 GF 그룹을 사용하십시오. 일반적으로, 실험 단위당 30개의 GFs의 그룹이 사용된다.
2. GF를 플라스틱 상자 (실험 장치)에 넣으십시오.
3. 평가를 위해 시험 제품을 다른 농도로 적용하십시오. 휴대용 분무기 장치로 응용 프로그램을 수행하십시오. 여기에서 5% 및 6%의 알칼로이드 에멀젼을 시험하였다.
4. 대조군으로 GF 그룹을 물에 뿌리십시오.
5. 치료 당 적어도 세 번의 반복 (실험 단위)을 활용하고 차례로 분무하십시오.
6. 멸균 후드에서 GF 당 두 개의 CBB 성인을 방출하십시오 (총 60 개의 CBB가 플라스틱 상자에 도입됩니다). 30 분 후에 상자를 덮으십시오.
7. 감염된 GF가 있는 플라스틱 박스를 통제된 조건(어두움, 25± 2°C, 상대 습도 71% ± 5%)의 실내 또는 인큐베이터에 두십시오.
8. 1, 7, 15 및 21 일 후에 각 상자의 과일 밖에서 보어 과일과 살아있는 곤충과 죽은 곤충의 수를 계산하십시오.
9. 감염 후 20 일 후, 입체 현미경, 배율 10x로 각 GF를 해부하십시오.
10. 각 과일의 곤충에 의해 손상된 건강한 씨앗이나 씨앗의 수를 계산하십시오.
11. 관찰된 상이한 CBB 생물학적 단계(²² )를 카운트하고, 실험 단위당 곤충 사망률을 결정하기 위해 각 종자에서 죽은 곤충의 수를 카운트한다.

5. CBB 감염 후 제품의 효과 평가(감염 후)(그림 3)

1. 치료 당 200 개의 과일 그룹을 사용하십시오.
2. 멸균 후드에서는 이전에 소독 된 GF에 CBB 성인 (CBB 성인 대 GF의 2 : 1 비율)을 방출하여 21 °C에서 3 시간 동안 감염을 진행할 수 있습니다.
3. GF를 검사하십시오. 3 시간 후, 대부분은 CBB의 복부가 여전히 노출되어 있어야합니다 (위치 A²⁰), 그림 2와 같이.
4. 46개의 감염된 GF(위치 A)를 선택하여 96웰 플라스틱 랙(실험 장치)에 배치합니다. 과일은이 위치에 있어야하므로 치료가 과일을 천공하는 CBB에 직접 뿌려질 수 있습니다.
5. 처리 당 적어도 세 번 (세 개의 랙)을 스프레이하고 30 분 후에 랙을 덮으십시오.
6. 감염된 GF가 있는 랙을 통제된 조건(어두움, 25 ± 2°C, 상대 습도 71% ± 5%)의 실내 또는 인큐베이터에 두십시오.
7. 20일 후, GF를 10x 배율로 입체현미경으로 해부한다.
8. 각 과일의 곤충에 의해 손상된 건강한 씨앗이나 씨앗의 수를 계산하십시오.
9. 상이한 CBB 생물학적 단계(²² )와 각 종자에서 죽은 곤충의 수를 카운트하여 실험 단위당 곤충 사망률을 결정한다.

6. CBB에 억제 효과가있는 제품의 평가

1. 과일에 대한 보호 효과가있는 제품을 평가하기 위해 요약 된 4.1-4.6 단계를 따르십시오.
2. CBB 성인을 플라스틱 상자에 넣은 후 상자에서 날아 다니는 CBB의 수와 GF를 유추하는 수를 계산하십시오. 그런 다음 4.7-4.11단계를 수행합니다.
3. CBB 감염 후 제품을 평가하기 위해 요약 된 5.1-5.5 단계를 따르십시오.
4. 위치 A의 곤충에 각 처리를 살포 한 후, GF에서 이동하거나 GF에서 멀리 날아간 CBB의 수를 계산하십시오. 그런 다음 5.6-5.9단계를 수행합니다.

7. 통계 분석

참고: 반응 변수는 시간에 따른 사망률과 건강한 감염되지 않은 커피 씨앗의 비율입니다.

1. 각 치료에 대한 각 반응 변수의 평균 및 표준 편차를 추정한다.
2. 완전히 무작위화된 설계에 대한 모델을 사용하여 각 반응 변수에 대한 분산 분석을 수행합니다.
   참고 : Dunnett의 5 % 비교 테스트는 절대 제어 (물 제어)와 처리를 비교하기 위해 수행됩니다.
3. 치료법이 절대 대조군과 유의하게 다른 경우, 치료를 비교하기 위해 5 % 최소 유의성 차이 (LSD) 검사를 사용하십시오.
4. 시험의 검정력을 평가하십시오. 85%보다 크면 분산의 정상성과 동질성의 가정이 충족됩니다.

그림 1 : CBB에 대한 살충제의 감염 전 효과 평가 절차. 녹색 과일 (GFs)을 사용하여 hypothenemus hampei (CBB)에 대한 살충제의 감염 전 효과를 평가하는 단계. (A) 과일 선택. (B) 커피 과일에 살충제를 뿌리는 것. (C) GF 당 2:1 CBB의 비율로 커피 과일의 CBB 감염. (D) 감염된 과일. (E) 통제 된 조건 하에서 과일의 배양. (F) 과일 해부. (G) 종자 내부의 CBB 개체군을 세는 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 커피 과일의 CBB 감염 처리. 감염된 과일에는 복부가 부분적으로 노출 된 CBB 성인이 포함되어 있습니다 (위치 A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : CBB에 대한 살충제의 포신 감염 효과 평가 절차. GFs를 사용하여 CBB에 대한 살충제의 감염 후 효과를 평가하는 단계. (A) 과일 선택. (B) GF 당 2 : 1 CBB의 비율로 CBB로 과일을 감염시킨다. (C) 감염된 과일의 선택. (D) 과일에 살충제를 뿌리는 것. (E) 과일의 배양. (F) 과일 해부. (G) CBB 인구를 세는 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

결과는 CBB 암컷이 과일을 인식하고 과일 표면의 특성과 방출 된 냄새에 따라 CBB 암컷이 21 °C에서 3 시간 이내에 과일에 침투하거나 보어지기 시작했다는 것을 보여주었습니다.

24 시간 후 및 시간이 지남에 따라 커피 과일에 적용될 때 CBB에 대한 살충제의 영향 (preinfestation procedure)은 그림 4에 나와 있습니다. 두 살충제 (5 % 및 6 %의 알칼로이드 에멀젼)는 20...

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토론

이 프로토콜에서 곤충뿐만 아니라 과일의 소독은 중요한 단계입니다. 밭의 과일을 실험실에서 사용하면 미생물과 진드기가 표피 ^7,15,16에 존재하기 때문에 높은 오염과 탈수를 자주 보입니다. 따라서 소독되지 않은 과일이나 곤충을 사용하면 박테리아 나 곰팡이와 같은 미생물에 의한 오염으로 인해 곤충이 사망하여 생물 분?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker with spout, low form 500 mL	BRAND PP	BR87826
Benchtop Shaker	New Brunswick Scientific Innova 4000 Incubator Shaker
Dishwashing liquid soap-AXION	Colgate-Palmolive	AXION
Hood; Horizontal Laminar Flow Station	Terra Universal		Powder-Coated Steel, 1930 mm W x 1118 mm D x 1619 mm H, 120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html)
Insects CBB	BIOCAFE		(http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html).
Multi Fold White paper towels	Familia	73551
Preval Spray unit	Preval Merck	Z365556-1KT	https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ 5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB
Reversible Racks 96-Well	heathrowscientific	HEA2345A	https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a
Scalpel blades N 11	Merck	S2771-100EA
Scalpel handles N3	Merck	S2896-1EA
Sodium Hypochloride	The clorox company	Clorox
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi 508	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html