광간섭 단층촬영을 통한 쥐 맥락막의 흑색종 이식 및 평가

요약

현재 프로토콜은 광간섭 단층촬영을 사용하여 쥐 맥락막에 흑색종의 이식 및 평가를 설명합니다.

초록

실험적 맥락막 흑색종 모델을 확립하는 것은 올바른 국소화에서 종양을 유도하는 능력 측면에서 어렵습니다. 또한, 생체 내에서 후방 맥락막 흑색종을 관찰하는 데 어려움이 있어 종양 위치 및 성장 평가를 실시간으로 제한합니다. 여기에 설명된 접근 방식은 다단계 맥락막 B16LS9 세포 주입 절차를 통해 마우스에서 맥락막 흑색종을 확립하는 기술을 최적화합니다. 마우스 포도막의 작은 치수에 정밀하게 주입할 수 있도록 전체 절차를 현미경으로 수행합니다. 첫째, 결막 복막 절제술은 눈의 등쪽 측두엽 영역에 형성됩니다. 그런 다음 노출된 공막을 통해 바늘을 삽입하여 맥락막하 공간으로 관을 만듭니다. 그런 다음 무딘 바늘을 관에 삽입하고 흑색 종 세포를 맥락막에 주입합니다. 주사 직후 비침습적 광간섭단층촬영(OCT) 영상을 사용하여 종양 위치와 진행 상황을 결정합니다. 망막 박리는 종양 부위 및 크기의 예측 인자로 평가됩니다. 제시된 방법은 마우스에서 맥락막 국소 흑색종의 재현 가능한 유도 및 종양 성장 평가의 라이브 이미징을 가능하게 합니다. 따라서 안내 종양을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서문

포도막 흑색종(UM)은 성인에서 가장 흔한 안내 원발성 악성 종양입니다. 안구 흑색종의 약 90%는 포도막관 맥락막 부위의 멜라닌 세포에서 유래한다¹. UM은 환자의 약 50%가 전이성 질환을 앓고 있으며, 간은 전이의 주요 부위로 추정되기 때문에 이환율과 사망률의 주요 원인이다². 원발성 병변을 조기에 치료하면 전이 가능성을 줄일 수 있지만, 전이 형성을 예방하는 효과적인 치료법은 없다³.

포도막 흑색종의 표준 치료에는 시신경병증, 망막병증, 안구건조증 및 백내장으로 인한 시력 상실과 관련된 방사선 요법이 포함됩니다. 외과적 절제는 전형적으로 병변의 성장이 인식되고 특성화될 때까지 지연된다. 그러나, 이러한 지연은 전이성 질환 발병을 허용할 수 있다⁴. 어떤 경우에는 쓸데없는 적출이 필요합니다. 물론, 이 급진적인 시술은 시력을 손상시키고 극적인 미적 저하를 초래합니다.

포도막 흑색종을 연구하기 위한 실험 모델을 개발하는 데 많은 노력이 있었습니다. 이 악성 종양을 정확하게 평가할 수 있는 전임상 동물 모델은 포도막 흑색종에 대한 새로운 진단 및 치료 전략을 조사하는 데 중요합니다. 안구 흑색종의 실험 동물 모델은 주로 생쥐, 쥐 및 토끼의 종양 세포 접종을 기반으로 합니다 ^5,6. 마우스 모델은 빠른 번식률과 인간과의 높은 게놈 유사성으로 인해 비용 효율적이며 흑색종 연구에 널리 사용됩니다. 쥐 피부 흑색종 세포주 B16은 일반적으로 C57BL6 마우스를 접종하고 동계 종양을 유도하는 데 사용됩니다. 이 모델을 사용하여 포도막 흑색종을 유도할 때 종양이 있는 눈은 일반적으로 접종 후 7-14일 후에 적출해야 합니다. 또한, B16은 매우 침습적인 모델이다. 눈의 면역 특권 특성은 전이를 지원하며 전이는 일반적으로 종양 세포 접종 후 3-4주 후에 감지될 수 있습니다. 원래 B16 계통의 계대배양은 뚜렷한 전이적 특성을 나타낸다⁶. 예를 들어, 퀸즈 흑색종 계통은 전이율이 높습니다 ^7,8. B16LS9 세포주는 수지상 세포 형태를 가지며 모 피부 흑색종 계통 B16F1을 주사한 C57BL/6 마우스의 간 전이에서 유래되었습니다⁹. 눈의 후방 구획에 주입했을 때, 이들 세포는 조직학적으로 인간 포도막 흑색종과 유사하고 C57BL/6에서 간 특이적 전이를 형성하지만 Balb/C, 마우스^10,11,12에서 간 특이적 전이를 형성하는 것으로 나타났습니다. 유전적으로, 세포는 간세포 성장 인자¹³에 대한 세포 수용체로서 작용하는 c-met 원발암유전자의 더 높은 발현을 특징으로 한다. 대조적으로, 부모 B16의 10^번째 통로인 B16F10은 안구 내 접종 시 주로 폐로 전이된다¹⁴. B16F10과 B16LS9는 모두 색소가 있다¹².

몇 가지 주요 과제는 쥐 포도막 흑색종 모델의 성공을 제한합니다. 첫째, 종양 세포 역류는 안구외 또는 결막하 흑색종을 유발할 수 있습니다. 둘째, 흑색종 세포의 안내 접종 후 종양 성장은 종종 매우 가변적이어서 치료 및 진행 상황을 평가하는 데 어려움을 겪습니다. 또 다른 주요 어려움은 생체 내에서 종양 성장을 추적하는 능력이 제한되어 있다는 것입니다. 루시페라아제 발현 종양과 같은 생체발광 영상화는 안구 종양 성장을 모니터링하기 위해 일반적으로 사용되지만^15,16, 종양의 안구 내 위치에 대한 정보를 제공할 수 없다. 그러므로, 종양의 평가는 전형적으로 눈의 적출술 후에 수행된다^10,17. 이것은 종양 진행 및 치료에 대한 반응을 광범위하게 특성화하는 능력을 크게 제한합니다. 포도막 흑색종 연구의 또 다른 주요 장애물은 색소 생쥐의 병변을 모니터링하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 이러한 어려움을 극복하는 새로운 접근법은 동물 모델에서 포도막 흑색종 연구를 촉진하기 위해 필요합니다.

광간섭 단층촬영(OCT)은 고해상도로 눈의 여러 부분을 심층적으로 영상화할 수 있는 독특한 기능을 제공하며, 이는 초음파^18,19를 포함한 다른 방법론과 비교할 수 없습니다. OCT 영상은 다양한 안구 질환을 연구하기 위해 동물 모델에서 사용되어 왔다²⁰. 최근에, OCT 영상은 안구 내 종양 성장을 평가하기 위한 비침습적 수단으로서 입증되었다²¹. 여기에 설명된 프로토콜은 쥐 맥락막에 흑색종 세포를 이식하고 세포 접종 시 안구 내 종양 국소화 및 크기를 예측하기 위한 OCT의 활용을 묘사합니다.

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프로토콜

프로토콜의 실험은 이스라엘 국립 동물 실험 위원회(Israel National Council on Animal Experimentation)의 승인을 받았으며 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수합니다. 8-10주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 본 연구에 사용했으며 12/12시간 명암 주기에 노출되었습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조).

1. 세포 배양

1. B16LS9 세포를 RPMI 1640 배지에서 배양하고, 10% 소 태아 혈청, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 25mM HEPES, 1% 필수 비타민 혼합물, 200U/mL 페니실린 및 200mg/mL 스트렙토마이신( 재료 표 참조)을 5%_CO2로 가습된 37°C 배양기에서 보충했습니다.
2. 70%-80% 합류점에서 주입할 세포를 수확합니다.

2. 동물 준비

1. 케타민(75mg/kg 체중)과 메데토미딘(0.5mg/kg 체중)의 마취 혼합물을 준비합니다. 마취 혼합물을 단일 주사로 복강 내 주사하여 마우스를 마취시킵니다.
2. 국소 안과 마취제 옥시부프로카인(0.4%)을 양쪽 눈에 바릅니다.
3. tropicamide (0.5 %)를 국소 적으로 적용하여 마우스 동공을 확장하십시오.

3. 결막 복막 절제술과 공막관을 맥락막하 공간으로 만들기

1. 건조를 방지하기 위해 1.4% 하이드록시에틸셀룰로오스( 재료 표 참조)를 양쪽 눈에 윤활제로 바르십시오. 오른쪽 눈에 0.5% 트로피카마이드를 바릅니다.
2. 수술 현미경으로 마우스의 수술된 눈을 관찰합니다( 재료 표 참조). 멸균 된 인공 집게로 눈꺼풀을 벌립니다.
3. 안내 겸자를 사용하여 상측두엽 윤부 결막을 잡고 비강 하부 위치²² 쪽으로 당깁니다. 전체 절차 동안 이 위치를 유지하여 고정합니다(그림 1A).
4. 30G 바늘 끝을 사용하여 윤부 뒤쪽 약 1-2mm의 등측두엽에 작은(1-2mm) 결막 복막절개술을 합니다.
   참고: 더 미세한 바늘을 사용하면 과도한 천공을 방지하고 종양 위치를 더 정확하게 파악할 수 있습니다.
5. 복막 절제술의 개구부에서 과도한 Tenon의 캡슐을 제거하십시오.
   참고: 장부 캡슐은 눈의 지구를 둘러싸고 있는 조밀한 결합 조직 층입니다²².
6. 이 위치에 바늘 끝을 삽입하여 공막을 관통합니다. 공막의 노출된 백질을 통해 맥락막의 갈색이 나타날 때까지 맥락막하 공간으로 관을 만들기 위해 절제합니다(그림 1B).

그림 1: 종양 세포 접종 . (A) 상측두엽 윤부 결막을 안구내 겸자를 사용하여 잡고 비강 하부 위치로 당깁니다. (B) 30G 바늘 끝을 삽입하여 공막을 관통하고 절제하여 맥락막하 공간에 트랙을 만듭니다. (C) 세포가 적재되고 32G 바늘이 장착된 주사기를 트랙에 삽입하고 세포를 주입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 흑색종 세포의 접종

1. 2μL의 PBS에 70,000개의 B16LS9 세포를 재현탁합니다. 이 양은 눈당 추정됩니다.
2. 45° 각도로 꼬인 32G 무딘 바늘이 장착된 멸균된 10μL 유리 Hamilton 주사기( 재료 표 참조)에 세포를 로드합니다.
3. 로드된 주사기 바늘을 3단계에서 만든 트랙에 약 2mm 삽입합니다.
4. 2 μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
5. 주사 후 모든 체액이 제거될 때까지 2-3초 동안 바늘을 제자리에 고정합니다.
6. 트랙에서 누출되지 않도록 바늘을 부드럽고 천천히 당겨 제거합니다(그림 1C).
   참고 사항 : 주사 속도와 힘을 조정하면 종양 발달 패턴에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 매개변수는 적용된 올바른 힘과 속도를 식별하기 위해 실험하는 개인이 보정하는 것이 좋습니다. 예비 실험에서 총 70,000개의 세포가 결정되었습니다. 그러나 세포 배양 유형이나 배치 또는 마우스 균주 간에 차이가 있을 수 있으므로 이 수치의 보정이 필요합니다.

5. 주사 위치 평가

1. 흑색종 세포 접종 직후 OCT 스캔으로 주입된 눈을 관찰하여 유리체에서 망막 박리(RD), 망막 손상 및/또는 세포의 출현을 확인합니다²³.
   참고 사항 : 필요에 따라 tropicamide, oxybuprocaine 및 ethylcellulose를 다시 바르십시오.
2. 단계 5.1로부터의 OCT 스캔에 기초하여, RD 패턴들(²¹ )을 다음에 따라 분류한다: (1) RD의 로컬 RD-1 사이트; (2) 유리체 내 관찰 세포 물질로의 누출; (3) RD의 확장 된 RD 다중 사이트.
3. 종양 국소화를 기초로 예측한다: (1) 국소 RD-예상 맥락막 종양; (2) 유리체에서 예상되는 종양 내로의 누출; (3) 확장된 RD 예상 가변 및 분산된 종양(그림 2).
   참고: 국소 RD(약 50%)가 있는 마우스만 맥락막에 국한된 종양이 발생할 것으로 예상됩니다.

6. RD 높이를 기준으로 종양 크기 예측

1. OCT 분할/분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 OCT 스캔에서 로컬 RD의 높이를 측정하고 다음 그룹에 따라 분류합니다: 소형 = <300μm; 매체 = 300-400 μm; 대형 = >400 μm.
2. 다음 기준에 따라 종양이 주사 후 5일 이내에 도달할 것으로 예상되는 부피를 평가합니다.
   작은 RD 높이는 전형적으로 작은 크기의 종양에서 관찰된다 (종양 부피는 0.0059 mm3 내지 0.07 mm3이고 평균 부피는 0.027 ± 0.005^mm3이다).
   중간 RD 높이는 중소 종양 모두에서 발견됩니다(종양 부피 범위는 0.015mm3 내지 0.15mm3, 평균 부피는 0.056mm^± 0.016mm3).
   큰 RD 높이는 최대 0.36^mm3의 광범위한 종양 용적과 관련이 있습니다.
   참고: 예상 종양 크기의 범위는 이전 결과에서 얻었으며 소형, 중형 및 대형 종양의 세 그룹으로 나뉩니다.

7. 수술 후 절차

1. 안과용 ofloxacin 0.3%를 국소적으로 적용하십시오.
2. 아티파메졸 염산염(3mg/kg)을 피하 주사하여 마취를 역전시킵니다.
3. 부프레노르핀(0.05mg/kg 체중)을 3일 동안 1일 2회 피하 주사하여 동물의 통증과 고통을 줄입니다.
4. 흑색종 세포 주입 후 5일째에 아래 단계에 따라 종양 크기를 평가합니다.
   1. 단계 2.1에 설명된 대로 마우스를 마취합니다. 트로피 아미드 (0.5 %)를 바르십시오.
   2. 세로 및 시상 OCT 스캔으로 눈을 검사하고 OCT 분할/분석 소프트웨어를 사용하여 종양 부피와 국소화를 측정합니다.
   3. 공식²⁴를 사용하여 종양 부피를 계산합니다: V = a*b*c*6/π(각각 a, b 및 c = 길이, 너비 및 높이).
   4. 7.4.1-7.4.3 단계에 설명 된대로 2-3 일마다 종양 크기를 검사합니다.
      참고: 다른 마우스 균주 또는 세포주를 사용하는 경우 절차를 최적화해야 합니다.

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결과

B16LS9 세포 주입 직후 OCT를 통해 눈을 검사하였다. 주사 후 국소 망막 박리가 관찰되었습니다. 마우스는 초점(그림 2, 상부 패널), 유리체로의 누출(그림 2, 중간 패널) 및 확장된 RD(그림 2, 하단 패널)의 세 가지 RD 패턴을 나타냈습니다. 확장 RD는 주사로 인한 손상으로 인해 발생할 수 있습니다. 주사 직후의 RD 패턴과 주사 후 5...

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토론

포도막 흑색종은 새로운 치료법이 절실히 필요한 치명적인 질병입니다. 그러나, 포도막 흑색종 및 잠재적 치료법에 대한 연구는 포도막 흑색종 동물 모델 ^1,25의 기술적 과제에 의해 제한된다. 암세포의 안구 내 주입에 의해 유도되는 안구 종양은 마우스 눈의 크기가 작기 때문에 국소화와 크기 모두에서 매우 다양합니다. 이러한 가변성은 종양 진행의 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)	Hamilton	721711
30 G needles	BD Microbalance	2025-01
Atipamezole hydrochloride	Orion Phrma
B16LS9 cells	from Hans Grossniklaus USA
Buprenorphine	richter pharma	102047
C57BL/6 female mice	Envigo
Essential vitamin mixture	satorius	01-025-1A
Fetal bovine serum	rhenium	10270106
HEPES	satorius	03-025-1B
Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops	Fisher Pharmaceutical	390862
InSight OCT segmentation software	Phoenix Micron, Inc
Ketamine	bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
L-glutamine	satorius	03-020-1B
Medetomidine	zoetis (vetmarket)	102532
Ofloxacin 0.3% eye drops	allergan	E92170
Optical coherence tomography	Phoenix Micron, Inc
Oxybuprocaine 0.4%	Fisher Pharmaceutical	393050
Penicillin-streptomycin-amphoteracin	satorius	03-033-1B
Phosphate buffered saline (PBS)	satorius	02-023-1a
RPMI cell media	satorius	01-104-1A
Sodium pyruvate	satorius	03-042-1B
Surgical microscope	Zeiss	OPMI-6 CFC
Tropicamide 0.5%	Fisher Pharmaceutical	390723