transfection된 HeLa 세포의 이미징을 시작하려면 이미징 소프트웨어에서 생성된 강도 히스토그램을 기반으로 라이브 뷰 모드에서 개별 형광 채널에 대해 충분히 긴 노출 시간을 선택하십시오. Z축에서 이미징을 위한 적절한 평면 수를 설정합니다. 웰별로 표시할 적절한 수의 보기 필드를 선택합니다.
획득한 이미지의 정량 분석을 시작하려면 모든 형광 채널의 모든 이미지에 대해 배경 보정을 수행합니다. 분석된 객체의 크기에 따라 적절한 필터 크기를 선택합니다. 다음으로, 세포핵에 해당하는 채널에 대한 배경에 대한 형광 신호의 세기의 비율에 따라 주 물체의 마스크를 만들어 영상 분할을 시작한다.
주어진 구조에 적합한 형광 채널을 사용하여 BrdU 및 미토콘드리아 DNA 스팟을 나타내는 하위 물체에 대한 마스크를 만듭니다. 파라미터를 설정하고 모든 형광 채널에 대해 각 마스크 내의 개별 픽셀의 강도를 측정합니다. BrdU 또는 미토콘드리아 DNA 채널에 대한 총 형광 강도를 얻기 위해, 주어진 세포핵에 할당된 모든 하위 개체의 강도를 합산한다.
평균 형광 강도를 구하려면, 총 형광 강도를 주어진 세포핵에 할당된 하위 개체의 면적의 합으로 나눕니다. 정량적 real-time PCR을 이용하여 미토콘드리아 DNA와 유전자 발현 정도를 측정하여 영상 결과를 검증하였다. 디데옥시시티딘 또는 DDC로 치료하면 미토콘드리아 DNA 수준이 매우 크게 감소했습니다.
TFAM 및 TWINKLE 헬리카제 침묵에서 약한 효과가 관찰된 반면, 미토콘드리아 DNA 중합효소 감마 또는 POLG siRNA를 사용한 세포의 형질감염은 미토콘드리아 DNA 복제 수에 약간의 영향을 미쳤습니다. TFAM 및 TWINKLE 헬리카제 발현을 정량화한 결과, 이들의 mRNA 발현이 대조군 수준의 약 15 내지 20%까지 효율적으로 감소하는 것으로 확인되었다. POLG에서 mRNA 발현은 30%로 감소했으며, 이는 미토콘드리아 DNA 복제 수에 대한 예상치 못한 겸손한 효과를 설명합니다.
