냉동 해리 된 배아 심장 세포 현탁액을 섭씨 37 도의 수조에 1-2 분 동안 냉동 해리 된 배아 심장 세포 현탁액을 넣는 것으로 시작하십시오. 해동 된 현탁액에 섭씨 37도에서 미리 데온 된 완전한 배지 1 밀리리터를 넣고 피펫으로 3 번 혼합하십시오. 그런 다음 서스펜션을 10 밀리리터의 따뜻한 완전 매체가 들어있는 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
전체 세포 현탁액을 30 마이크로 미터 여과기에 통과시키고 1-2 밀리리터의 따뜻하고 완전한 배지로 여과기를 헹굽니다. 동일한 원뿔형 튜브에서 흐름을 수집합니다. 다음으로, 튜브를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다.
상청액을 제거한 후, 펠릿을 PBS로 세척하고, 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 옮긴다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 제공된 자성 마이크로비드의 100 마이크로리터를 펠릿화된 세포에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 배양하기 전에 넓은 멧돼지 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 5회 균질화합니다.
그 동안 자기 분리 컬럼을 500마이크로리터의 결합 완충액으로 헹굽니다. 인큐베이션이 완료되면, 500 마이크로리터의 결합 완충액을 사용하여 마이크로비드 세포 현탁액 혼합물을 희석한다. 다음으로, 0.6 밀리리터의 세포 현탁액을 자기 분리 컬럼에 첨가한다.
15밀리리터 원심분리기 튜브에 살아있는 세포 폐수를 수집합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 결합 완충액을 사용하여 세포 현탁액을 함유하는 1.5 밀리리터 마이크로 튜브를 헹굽니다. 헹굼 후 결합 버퍼를 1.5밀리리터 마이크로 튜브에서 컬럼으로 옮기고 동일한 15밀리리터 튜브에 폐수를 수집합니다.
1 밀리리터의 결합 버퍼를 사용하여 1.5 밀리리터 튜브의 헹굼을 반복하십시오. 300G에서 5분 동안 유출물을 원심분리한 후, 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 제거한다. PBS BSA 용액 1밀리리터를 첨가하고 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 옮깁니다. 다시, 세포 현탁액을 원심분리하고 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상층액을 제거합니다. PBS BSA 1밀리리터의 2회 세척을 반복합니다.
1 밀리리터의 PBS BSA를 제거한 후, 세포를 100 마이크로리터의 PBS BSA 용액에 재현탁시킨다. 피펫팅으로 10회 혼합합니다. 100, 000개 이상의 세포 수를 확인하기 위해 트립판 블루 분석을 수행하여 농도를 결정하고 세포의 생존력에 대한 형광 기반 평가를 수행합니다.
해동 후 죽은 세포를 분류 및 제거하는 추가 단계는 상당히 높은 세포 생존율을 갖는 더 깨끗한 세포 현탁액의 조달을 허용하고 출발 샘플의 품질을 개선시켰다. 정확도를 높이기 위해 트리판 블루와 형광 기반 생존력 평가를 포함하여 세포와 핵을 정량화하기 위해 두 가지 다른 계수 방법이 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 세포 생존율은 핵 분리 전 80 내지 90%에서 핵 분리 후 5% 미만으로 전달되는 것으로 관찰되었다.
