시작하려면 배양하기 전에 150 마이크로 리터의 0.01 %에서 0.1 % 세포 부착 용액으로 마이크로 웰 접시를 코팅하십시오. 접시가 공기 중에서 건조되면 80마이크로리터의 금 나노 입자 용액을 건조한 표면에 한 방울 떨어뜨립니다. 다음 날, 마이크로 웰에서 추가된 배양 배지를 제거합니다.
그런 다음 유리 표면의 고정된 금 나노 입자 위에 형질주입된 세포 2밀리리터를 추가합니다. 실험을 시작하기 전에 플레이트를 배양합니다. 장기 레이저를 488나노미터로 설정한 컨포칼 현미경을 사용하여 annexin 단백질의 GFP 형광을 확인합니다.
헬륨 네온 레이저를 633나노미터로 설정하여 금 나노 입자 반사를 관찰합니다. 원형질막의 겹침을 방지하기 위해 세포 클러스터 대신 단일 세포를 선택합니다. 고정된 금 나노 입자가 단일 입자로 존재하고 열 구배 증가를 방지하기 위해 적절한 간격으로 존재하는지 확인합니다.
광학 핀셋을 사용하여 금 나노 입자를 1초 동안 조사하여 원형질막을 파괴합니다. 거대한 단층 소포 또는 GUV를 생성하려면 유리 슬라이드에 따뜻하게 데운 5% PVA 겔 90마이크로리터를 도포합니다. 슬라이드 위에 젤을 균일하게 펴 바릅니다.
그런 다음 슬라이드를 섭씨 50도의 가열 캐비닛에서 50분 동안 건조시킵니다. 다음으로 유리 주사기를 사용하여 30마이크로리터의 지질 혼합물을 도포합니다. 바늘 가장자리로 혼합물을 얇은 필름으로 펴십시오.
지질 혼합물의 클로로포름을 증발시키기 위해 질소 가스를 부드럽게 흘려보냅니다. 그런 다음 슬라이드를 진공 상태에서 1.5-2시간 동안 건조시킵니다. 별도의 2밀리리터 튜브에 400마이크로리터의 성장 완충액을 추가합니다.
그런 다음 관심의 재조합 단백질을 500 나노 몰의 최종 농도에 첨가합니다. 400 마이크로리터의 희석된 단백질을 조립된 사내 챔버에 피펫팅하고 챔버를 PERIPL로 감쌉니다. 1시간 배양 후 챔버 내용물 400마이크로리터를 2밀리리터 튜브에 옮깁니다.
수집된 용액에 1m리터의 관찰 완충액을 추가하여 캡슐화되지 않은 단백질을 제거합니다. 그런 다음 용액을 섭씨 600도에서 10분 동안 13G로 원심분리합니다. 다음으로, 1밀리리터의 상층액을 관찰 완충액으로 교체하고 부드럽게 피펫팅하여 GUV를 분산시킵니다.
실험이 시작될 때까지 냉장 보관하십시오. GUV에 구멍을 뚫으려면 먼저 35mm 유리 바닥 접시의 표면을 베타 카제인으로 코팅합니다. 다음으로, 염화칼슘을 함유한 GUV 혼합물에 5마이크로리터의 150나노미터 금 나노 쉘을 첨가합니다.
혼합물을 챔버로 옮기고 현미경 스테이지에 장착합니다. 광학 핀셋을 사용하여 GUV 표면에 개별 금 나노 쉘을 가둡니다. 갇힌 나노 쉘이 GUV 멤브레인과 밀접하게 접촉하면 레이저 출력을 높여 대상 부위에 구멍을 뚫습니다.
나노 입자 조사는 막 손상을 초래하고 칼슘 유입에 따라 손상 부위에 아넥신을 빠르게 모집하여 고리 모양의 구조를 형성했습니다. GUV 실험에서 멤브레인 펑크는 부속물이 없는 상태에서 빠르게 재밀봉되었습니다. annexin A 4 단백질의 독특한 생물물리학적 특성으로 인해 GUV는 막을 굴리는 능력으로 인해 파열되었습니다.
GUV에 있는 annexin의 존재는 막 천자 후 손상 부위에 빠른 축적을 일으켰습니다. 세포 실험에서 아넥신 A 5 고리를 분석한 결과, 시간과 공간에 따라 일정하게 유지되는 것으로 나타났습니다. 열플라즈모닉스를 이용한 원형질막 파괴는 칼슘 이온 수치를 상승시켰다.
세포는 6.6초에 최대 칼슘 강도에 도달했으며, 이 시점은 상처 봉합 시간에 해당하는 것으로 추정됩니다.
