CENP-E Knockout HeLa 세포의 형질주입, 분리 및 스크리닝

먼저 0.25%Trypsin-EDTA 용액을 HeLa 세포에 넣고 섭씨 37도에서 2-3분 동안 배양합니다. 피펫팅을 통해 세포를 부드럽게 해리하고 세포 통과를 위해 1:4의 비율로 새 플레이트에 파종합니다. 플라스미드를 HeLa 세포에 transfection하려면 검증된 PX458 sgRNA 플라스미드 1마이크로그램을 튜브 A.In 튜브 B에 있는 50 마이크로리터의 환원 혈청 배지와 혼합하고 2 마이크로리터의 transfection 시약과 50 마이크로리터의 환원 혈청 배지를 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 튜브 A와 B의 내용물을 결합하고 실온에서 5분 더 배양합니다. 혼합물을 12웰 플레이트에 넣고 섭씨 37도에서 6시간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 배지를 새 DMEM 배지로 교체합니다.

24시간 또는 48시간 후 형광 현미경으로 HeLa 세포를 검사하여 transfection 효율을 평가합니다. 0.25%트립신 EDTA를 사용하여 형질주입된 HeLa 세포를 완전히 해리하고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 그런 다음 Neubauer 챔버 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.

연속 희석 방법에 따라 각 transfection된 집단에 대해 세포를 3개의 개별 96웰 플레이트로 패팅합니다. 세포를 가습 인큐베이터에 1-2주 동안 다시 넣습니다. CENP-E Knockout의 표현형 기반 스크리닝 및 검증을 위해 5-7일 동안 24-웰 또는 12-웰 플레이트에서 세포를 해리하고 확장합니다.

10배 및 20배 배율의 대물 렌즈가 있는 도립 현미경을 사용하여 더 작은 콜로니 직경을 가진 돌연변이 세포를 스크리닝합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 Column Animal Genomic DNA Extraction Kit를 사용하여 DNA 추출을 위한 세포를 수확하고 중합효소 연쇄 반응을 설정합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 표적 DNA를 pMD18-T 벡터에 연결합니다.

ligated plasmid를 유능한 DH5-Alpha 세포에 transfection하고 클론 선택을 위한 배양을 진행합니다. CENP-E Knockout의 유형을 식별하려면 제조업체의 지침에 따라 Plasmid Extraction Kit를 사용하여 plasmid DNA를 분리합니다. 다음으로, M13 forward 및 reverse primer를 사용하여 각 colony의 plasmid DNA에 대한 Sanger sequencing을 수행합니다.

야생형 및 CENP-E 돌연변이 HeLa 세포를 24웰 플레이트의 12mm 유리 커버 슬립에 파종합니다. 전체 DMEM 배지를 제거하고 4% 파라포름알데히드와 PBS 용액을 사용하여 실온에서 10분 동안 세포를 고정합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 DAPI로 핵을 염색합니다.

형광 현미경을 사용하여 염색체 정렬 표현형을 기반으로 CENP-E 돌연변이 세포를 관찰하고 검증합니다. 콜로니의 표현형 스크리닝은 CENP-E Knockout 세포가 대조군에 비해 염색체 정렬 불량이 증가했음을 보여주었습니다.