CRISPR/Cas9 매개 CENP-E Knockout HeLa 세포의 면역형광 염색 및 고분해능 공초점 현미경

시작하려면 커버 슬립에서 자라는 야생형 및 CENP-E 돌연변이 HeLa 세포 플레이트를 가져 가십시오. 4% 파라포름알데히드와 PBS 고정 용액으로 실온에서 10분 동안 세포를 고정합니다. 그런 다음 각각 5분씩 두 라운드 동안 PBS에 몰입합니다.

다음으로, 실온에서 10분 동안 0.25%Triton X-100 및 PBS로 세포를 투과시킵니다. 각각 5분씩 두 라운드 동안 PBS에 몰입시킵니다. 실온에서 1시간 동안 0.1%Tween 20으로 1%BSA PBS로 세포를 차단합니다.

1 % BSA 및 PBST에 1 차 항체를 희석하고 샘플을 섭씨 4도에서 12 시간 동안 배양합니다. 1차 항체 용액을 폐기합니다. 그런 다음 PBS로 각각 5분 동안 세포를 세 번 헹굽니다.

희석된 2차 항체를 세포에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 2차 항체를 폐기합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 각각 5분 동안 세 번 헹굽니다.

실온에서 5분 동안 DAPI를 사용하여 핵을 염색합니다. 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 매니큐어로 밀봉합니다. 63배 배율, 1.40 개구수 대물렌즈가 장착된 주사 컨포칼 현미경을 사용하여 형광 이미지를 관찰하고 추가 분석을 위해 기록합니다.

대조군 및 CENP-E 돌연변이 그룹의 면역형광 염색은 CENP-E 돌연변이 클론 1 세포에서 CENP-E 단백질의 형광 강도가 완전히 녹아웃되고 CENP-E 돌연변이 클론 3 세포에서 현저히 감소하는 것을 보여주었습니다. 염색체 정렬이 불량한 중기 세포의 비율은 대조 세포에 비해 클론 1 및 3에서 증가했습니다. 한편, 중기 세포의 비율은 클론 1 세포와 클론 3 세포에서 유의하게 증가하였다.

또한, CENP-E 결실 후 클론 1 및 3 그룹에서 간기 세포의 비율이 대조군에 비해 약간 증가했다. 전단계, 아나페이즈 및 텔로페이즈 세포의 비율은 CENP-E 결실 후 약간 감소한 반면, 중기 세포의 비율은 CENP-E 결실 후 증가했습니다.