시작하려면 하이드로겔 캡슐화된 세포가 24웰 플레이트에서 배양되는 웰에서 배지를 흡입합니다. 하이드로겔이 들어 있는 각 웰에 500마이크로리터의 PBS를 직접 피펫팅하여 하이드로겔을 헹구고 PBS를 부드럽게 흡입합니다. 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여, 웰당 500 마이크로리터의 고정 용액을 추가하여 24웰 플레이트에 스페로이드를 고정합니다.
정착액을 실온에서 30분 동안 담가두었다가 정착액을 피펫팅하여 지정된 폐기물 용기에 버리십시오. 다음으로, 이전에 설명한 대로 PBS로 하이드로겔을 세 번 헹굽니다. 즉시 사용하지 않을 경우 하이드로겔을 섭씨 4도에서 웰당 500마이크로리터의 PBS에 최대 1주일 동안 보관하십시오.
하이드로겔로 캡슐화된 세포를 염색하려면 먼저 nestin 및 SOX2에 대해 적절하게 희석된 1차 항체를 준비합니다. 웰에서 PBS를 흡입한 후 각 웰에 희석된 항체 50마이크로리터를 추가합니다. 항체로 세포를 24시간 동안 배양하여 완전히 염색합니다.
그런 다음 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 염색 용액을 제거하고 폐기물을 적절하게 폐기하십시오. 하이드로겔을 세 번 헹군 후 이미징 또는 즉시 이미징 전에 섭씨 4도의 PBS에 최대 2주 동안 보관하십시오. 이미징 투명도를 개선하기 위해 염색된 스페로이드를 제거하려면 먼저 각 웰에서 PBS를 흡입합니다.
그런 다음 스페로이드를 웰당 500마이크로리터의 20%40% 및 80%포름아미드로 각각 90분 동안 순차적으로 처리합니다. 마지막으로 이미징 전 24시간 동안 100% 포름아미드에 하이드로겔을 배양합니다. 스페로이드는 다양한 z-stack 깊이에서 이미지화되어 z-stack 내의 각 위치에서 세포 생존율을 평가할 수 있었습니다.
스페로이드 스택을 활용한 최대 투영은 각 위치 내에서 가장 높은 빛의 강도를 나타내며 하나의 이미지로 단순화되었습니다. 염색된 스페로이드의 대표 이미지는 자가 재생 전사 인자인 SOX2가 핵에서 DAPI와 함께 국소화되어 있음을 보여주었습니다. 반대로, 줄기세포 마커 네스틴은 세포 전체에 존재했습니다.
겔이 없는 자유 부유 스페로이드와 캡슐화된 스페로이드 사이에는 차이가 없었는데, 이는 아마도 사용된 PEG 겔의 불활성 때문일 수 있습니다. 약 90미크론에서 투명화된 스페로이드와 투명화되지 않은 스페로이드로 나뉜 광학 절편의 대표 이미지는 투명화가 수행될 때 투명화되지 않은 스페로이드에 비해 스페로이드 코어를 약 30미크론 더 깊게 이미징할 수 있음을 보여주었습니다.
