시작하려면 정제를 위해 FPLC 시스템을 준비합니다. 수동 지침 또는 맞춤형 방법을 사용하여 멸균 초순수로 액체 흐름 경로를 철저히 헹굽니다. 1밀리리터의 사전 충전된 헤파린 컬럼을 연결합니다.
압력 알람을 조정합니다. 그리고 분당 1밀리리터의 유속으로 5개의 컬럼 부피의 초순수로 세척합니다. 그런 다음 시스템 펌프용 솔루션을 전환하여 샘플 적용을 준비합니다.
시스템 펌프 B를 버퍼 B로 세척하고 나머지 액체 흐름 경로를 버퍼 A로 채웁니다.샘플 펌프의 샘플 튜브를 바이러스 제제에 삽입합니다. 또는 샘플에 대해 슈퍼 루프를 사용합니다. 배출 튜브를 새 용기에 삽입합니다.
처음으로 정제를 수행할 때 자동 정제를 위한 사용자 정의 방법을 정의하십시오. 일반 정제 설정을 활성화한 후 이 방법은 샘플 용액을 사용하여 샘플 입구 S1에서 주입 밸브까지의 흐름 경로를 프라이밍합니다. 그런 다음 분당 1밀리리터의 속도로 12.5%의 버퍼 B를 사용하여 총 5개의 컬럼 부피로 컬럼을 평형화합니다.
분당 0.5밀리리터의 속도로 샘플을 컬럼에 적용하고 출구 포트를 사용하여 흐름을 수집합니다. 분당 1밀리리터의 속도로 20컬럼 부피의 Buffer A로 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 이 방식으로 분당 1밀리리터로 샘플을 용리합니다.
분획 분취기를 사용하여 용리된 시료를 1밀리리터 분획으로 수집하려면 선택합니다. 그런 다음 5개의 컬럼 부피에 대해 12.5%의 버퍼 B를 사용하여 분당 1밀리리터로 컬럼을 다시 평형화합니다. 생성된 Method를 열고 용출 단계를 기다립니다.
분획 수집기를 사용하여 분수를 수집합니다. 또한 흐름의 부분 표본을 수집하고 분획을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 모든 정제 단계에서 자동으로 저장된 크로마토그램을 평가합니다.
용리 프로파일 포함. 완료 후 버퍼 용액의 주입구를 초순수로 전환하고 5개의 컬럼 부피에 대해 분당 1mL로 컬럼을 세척합니다. 컬럼을 복원하고 주입구를 초순수에서 20% 에탄올로 전환하고 컬럼을 5개의 컬럼 부피에 대해 세척합니다.
rAAV를 농축하려면 원하는 FPLC 분획을 100킬로달톤 분자량 컷오프가 있는 15밀리리터 원심 필터 장치에 로드합니다. 대략 500 microliters의 집중한 양에 도달하기 위하여 실내 온도에 2 분 동안 2, 000 G에 분리기. 원심 필터 장치에 1mL의 멸균 PBS를 추가하여 완충액 교환을 계속합니다.
피펫팅으로 필터를 세척합니다. 그리고 500 마이크로 리터의 부피에 도달 할 때까지 1 분 간격으로 원심 분리기. 이 500 마이크로리터 샘플을 100 킬로달톤 컷오프가 있는 0.5 밀리리터 원심 필터 장치로 옮겨 rAAV를 더욱 농축합니다.
그리고 6, 1 분 간격 동안 000 G에 양이 100개 미만 microliters일 때까지 분리. 필터 장치를 새 마이크로 원심분리기 튜브로 반전시키고 원심분리하여 rAAV를 튜브로 전달하여 농축된 rAAV를 회수합니다. rAAV를 저잔류 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.
rAAV 제제의 순도는 SDS 페이지를 사용하여 분석하여 뚜렷한 캡시드 단백질 밴드를 나타냈습니다. TEM에 의한 바이러스 입자의 시각화는 전자 밀도가 높은 중심과 전체 입자가 있는 빈 입자를 보여주었습니다. stunner 플랫폼을 사용하여 rAAV의 물리적 불순물 특성을 평가한 결과, 약 30나노미터의 온전한 캡시드 입자, 전체 캡시드 역가, 유리 및 응집된 단백질, 단일 가닥 DNA가 밝혀졌습니다.
신경 2a 세포의 감염성 분석은 높은 감염성 수준을 보여주었습니다. 바이러스 제제에 감염된 1차 신경 세포 배양이 입증되었습니다. 보존된 유전자 전달 특성.
rAAV 벡터를 가진 생쥐 소뇌의 생체내 transduction은 연장된 GFP 발현을 초래했다. 포유류의 뇌에서 성공적인 전이유전자 발현을 나타냅니다.
