Name: protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars at JoVE.com

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.

아래에서 설명한 순서에 따라 여기에 실험 프로토콜을 수행합니다. 미세 유체 플랫폼을 만들기위한 미세 프로토콜은 1 단계 2는 세균 배양 프로토콜 (그림 2)에 대해 설명하고, 3 단계 실험 장치 (그림 3)의 조립에 관한 단계에서 설명합니다. 마지막으로, 실제의 실험 공정은 단계 4에서 설명한다. 1 칩 제조 절차 참고 : 적절한 안전 절차는 아래에 설명 된 프로세스에 따라야합니다. 자세한 내용은 제도적 안전 요원에게 문의하십시오. <ol><li> 적절한 소프트웨어 (예를 들면, L-편집)와 마스크를 디자인합니다. 채널 디자인은 폭 625 μm의의 주요 마이크로 채널로 구성되어 있습니다. 채널의 중심 영역의 직경은 50 μm의가 (보조 파일 참조) 떨어져 25 μm의 간격 마이크로 게시물의 배열을 포함합니다. </li><li> 유리에이 디자인을 인쇄 (5 &quot;× 5&quot;소다 석회 유리), &quot;0.09의 두께를 가지며, 포토 마스크를 제조하기 위해서 마스킹하여, 크롬 (크롬)의 약 70 nm 두께의 층으로 코팅된다. 사용 AZ400K 현상 제 1 분간 어느. 후, 크롬 에칭 제를 이용하여 크롬 층을 에칭 약 1 분간 레지스트 차가운 피라냐 용액으로 닦아 제거하는 아세톤을 사용한다. (H 2 SO 4, H 2 (3)의 비율이 O : 1). </li><li> 포토 리소그래피 <ol><li> 20 분 동안 피라나 용액으로 화학적으로 표준 4 &quot;실리콘 웨이퍼를 청소합니다. </li><li> DI 워터와 웨이퍼를 헹구고 건조. </li><li> 핫 플레이트 (15 분 동안 200 ° C)에 웨이퍼를 가열. </li><li> 코팅 된 포토 레지스트와 실리콘 웨이퍼. 여기서, 포지티브 포토 레지스트 AZ4620는 12.5 μm의 두꺼운 층을 얻기 위해 25 초 동안 2000 rpm으로 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 - 코팅 하였다. </li><li> 100 ° C에서 질소 흐름에 90 초 동안 웨이퍼를 부동으로 핫 플레이트에 웨이퍼의 소프트 베이킹의 모든 용매를 제거합니다. 이어서, t 진공에 유지60 초 동안 그는 같은 온도. </li><li> 탈수 24 시간 동안 어두운 상자에 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 포토 레지스트로 설계된 패턴을 전사하기 위해 UV 광에 웨이퍼를 노출. </li><li> 240 초 동안 포토 레지스트 현상액 (AZ400K)에서 웨이퍼를 담근다. 이어서, 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 헹구고 질소 가스의 스트림에 배치하여 건조. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (유도 결합 플라즈마 - 딥 반응성 이온 에칭) 공정 <ol><li> DRIE 에칭을 적용합니다. 장치에 필요한 최종 깊이 (이 조사에서 50 μm의)에 따라 적절한 식각 깊이를 선택합니다. 포토 레지스트는 이러한 프로세스 동안 마스크 층으로서 작용한다. </li><li> 아세톤 남아있는 포토 레지스트를 제거하고 웨이퍼를 청소합니다. </li></ol></li><li> PDMS (폴리 디메틸 실록산) 주조 <ol><li> 실리콘 마스터 금형을 silanizing에 대한 trichloromethylsilane (TCMS)를 사용합니다. 유리 병에 trichloromethylsilane 2 ~ 3 방울을 붓고 옆에 데시 케이 터에 배치실리콘 마스터 몰드. silanizing 프로세스가 완료 될 때까지 2 ~ 3 시간을 허용합니다. </li><li> PDMS를 제조 1 : 별도의 용기에서, 10의 중량비로 경화제와 실 가드 184 실리콘베이스를 혼합한다. 조건 (약 2 시간)를 진공 청소기로 청소하는 데 쓰는하여 PDMS를 가스를 제거한다. </li><li> 홀더 실리콘 마스터 주형을 넣어. 이어서, PDMS 스탬프를 형성하는 실리콘 마스터 주형에 부어 PDMS. 거품이 과정에서 PDMS에 형성하지 않도록해야합니다. </li><li> 80 ° C에서 2 시간 동안 PDMS를 치료. </li><li> 필 마스터 금형에서 PDMS 스탬프 끕니다. 이어서, 별도의 마이크로 PDMS 스탬프로 자른다. 마지막으로, 입구 (들)와 출구 (들)에 구멍을 드릴 절단 코어를 사용합니다. </li></ol></li><li> 유리에 PDMS의 본딩 <ol><li> 30 초 동안 산소 플라즈마에 커버 슬립과 PDMS 스탬프를 노출. 커버 슬립에 본드 PDMS 스탬프입니다. </li><li> PDMS 스탬프 및 커버 슬립 사이에 적당한 밀봉을 달성하기 위하여, 10 분 동안 70 ° C에서 오븐에 넣어 어닐링 장치. </리&gt; </ol></li></ol> 2 세균성 문화 참고 : 적절한 바이오 안전성 프로토콜 단계 2-4에 따라야합니다. 자세한 내용은 제도적 안전 요원에게 문의하십시오. <ol><li> LB 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 1 L 플라스크에 20g 루리아 - 베르 타니 (LB) 한천 (밀러) 분말 및 초순수의 500 ML을 추가합니다. 분말을 용해 약동하십시오. </li><li> 15 PSI, 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 플라스크 벤치에 또는 바이오 안전성 후드에서 물을 욕조에 50 ~ 55 ° C까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 항생제 테트라 사이클린을 추가한다. 잘 저어 섞는다. </li><li> 접시에 혼합물을 부어. 전체 2/3 - 2까지 각 판을 채 웁니다. </li><li> 불꽃 공기가 형성하는 경우를 나타 짧게 거품. 응고 된 기포 위에 박테리아 배양을 전파하기 어렵다. </li><li> 판 하룻밤 실온에서 냉각시킵니다. </li><li> 그들은 멋진 때,자신의 소매로 다시 접시를 넣어 4 ℃에서 가방, 라벨 (항생제와 날짜) 및 저장을 봉인. 참고 : 빛이 많은 항생제를 비활성화로, 주석 호일 접시의 주식을 커버. </li></ol></li><li> LB 국물 준비 <ol><li> 20g 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (밀러) 분말 및 플라스크에 초순수의 1 L를 추가합니다. 분말을 용해 약동하십시오. </li><li> 15 PSI, 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 플라스크 벤치에 또는 바이오 안전성 후드에서 물을 욕조에 50 ~ 55 ° C까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 항생제 테트라 사이클린 (tetracycline)을 추가한다. 잘 저어 섞는다. </li><li> 때 멋진, 4 ° C에서 레이블 병을 배치합니다. 참고 : 빛이 많은 항생제를 비활성화로, 주석 호일로 병을 커버. </li></ol></li><li> LB 한천 접시에 문화 박테리아 (이 프로토콜을 사용하는 슈도모나스 fluorescens) <ol><li> (냉장고에서 -80 °를 박테리아의 주식을 가지고; C)과 얼음에 놓습니다. </li><li> -80 ° C 세균 주식 및 바이오 안전성 후드 내부 LB 한천 플레이트를 놓습니다. </li><li> 킬 지그재그 패턴 LB 한천 플레이트 상에 균주. 한천 플레이트를 덮고 하룻밤 30 ºC 그것을 품어. 마지막으로, 4 ° C에서 냉장고에 접시를 저장합니다. </li></ol></li><li> 박테리아 용액을 제조 (S1) <ol><li> 멸균 플라스크에 50 ㎖의 LB 국물 미디어를 붓고. 바이오 안전성 후드 내부에서이 작업을 수행합니다. </li><li> 플라스크에 LB 아가 플레이트로부터 박테리아 단일 콜로니를 전송합니다. 이 조작은 생물 안전성 후드 안쪽 수행되어야한다. </li><li> 30 ° C 및 충분한 시간 (4 시간) 150 rpm에서 진탕 배양기에서 플라스크를 넣습니다. </li></ol></li><li> 희석 세균 솔루션 (S2)를 준비 <ol><li> 멸균 플라스틱 튜브에 5 ㎖의 LB 국물 미디어를 붓고. </li><li> LB 국물 매체와 혼합하여 S1을 희석. 그런 다음 솔루션을 소용돌이. 용액은 목적하는 광학 달성 희석알 밀도 (OD 600 nm의 0.1에서 측정). 참고 : 바이오 필름 실험은 일반적으로이 부근에서 OD 값을 사용한다. </li></ol></li></ol> 3 실험 설치 준비 <ol><li> 핀셋은 마이크로 칩의 입구 (들)와 출구 (들)에 유연한 플라스틱 튜브 (0.20 &quot;ID)를 연결합니다. 입구와 출구가 이전에 마이크로 칩 (스텝 1.5.5)의 PDMS 부분에 드릴되었다.이 조사에서 마이크로 칩은 두 개의 입구와 하나의 출구로 구성되어 있습니다. </li><li> 박테리아 용액 (S2 용액) 주사기 (들)을 입력하고 주사기 (들)의 모든 거품을 제거합니다. </li><li> 입구 관 (들)에 주사기 팁 (들) (30 G 0.5 &quot;무딘 바늘)을 연결합니다. 그런 다음 컨테이너를 낭비 출구 관 (들)을 연결합니다. </li></ol> (4) 실험을 실행 <ol><li> 주사기 팁 (들) 주사기 (들)을 연결합니다. </li><li> 주사기 펌프 위에 장소 및 수정 주사기 (들). 그런 desir의 대물 렌즈와 광학 현미경 마이크로 칩을 배치에드 배율 (예를 들어, 40 배). 박테리아 증식 (P. 30 °의 C는 fluorescens) 동안 일정한 온도 환경을 유지하기 생균 챔버기구와 마이크로 칩을 포함한다. </li><li> 원하는 유량 레벨로 펌프 (예를 들어 10 μL / 시간)를 설정하고 유체 펌핑을 시작합니다. </li><li> 박테리아가 챔버 내로 도입되면, 바이오 필름 형성이 또한 개시된다. 바이오 필름 형성 및 성숙은 일반적으로 몇 시간 또는 며칠의 기간에 걸쳐 발생한다. 관찰하고 현미경을 통해 생물막 성장의 이미지를 가져 가라. </li></ol>

<ol>
	<li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms:+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections.">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Wong, G. C. L., O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+together+now:+Integrating+biofilm+research+across+disciplines.">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li><li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow.">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).</li><li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers.">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li><li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems.">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li><li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems.">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li><li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows.">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li><li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems.">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media.">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li><li>Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).</li><li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil.">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li><li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets.">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li><li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms.">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li><li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media:+energy+applications.">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 복잡한 서식지에서 바이오 필름 개발 연구를위한 다공성 미디어를 모방하는 간단한 미세 유체 장치를 보여 주었다. 실험의 결과를 지시 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그들은 장치의 형상을 포함한다. 포스트 형상은 다를 수 있지만, 깃발은 형성하기위한 적절한 기공 공간이 필요합니다. 더욱이 Valiei 외. 1 트리머 형성 할수 특정 유량 범위에서 발생 것을 증명했다. 임...

최근에, 우리는 다공질 일을 모방 한 미세 유체 장치에서 세균 biofilm 형성의 역 동성을 보여 주었다. 세균 바이오 필름은 기본적으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 2-4으로 쌌다 아르 표면 집계 박테리아의 식민지입니다. 세균이 박막은 부드러운 표면을 다공성 매체의 훨씬 더 복잡 서식지에 이르기까지 거의 모든 생각할 수있는 틈새 시장이 형성 될 수 있기 때문이다. Valiei 외. 1 다공질 구조를 시뮬레이션하기 위해 마이크로 - 기둥 배열을 미세 유체 소자를 사용 및 액체 유량의 함수로서이 장치에서 바이오 필름 ​​형성을 연구 하였다. 그들은 특정 흐름 정권, 깃발로 알려진 사상 바이오 필름은 다른 기둥 사이에 등장하기 시작 것을 발견했다. 깃발에 닿는 일 수 있거나 둘 고체 표면에 끝나지만 구조의 나머지는 액체 중에 현탁된다. 보리 형성은 일반적으로 시작하는 바이오 필름의 초기 층 형성과 그 형식 후이온은 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 장기적인 발전을 지시 할 수 있습니다. 최근 여러 연구자들은 유영 형성의 역학을 조사 하였다. 야 즈디 등. 5는 깃발이 진동 거품에서 발생하는 와류 흐름에 형성 할 수있는 것으로 나타났다. 또 다른 실험에서, Rusconi가 외. 6 깃발의 형성에 채널 곡률 및 채널 형상의 효과를 조사 하였다. 그들은 깃발이 마이크로의 굴곡 부분에 형성 할 수있는 것을 발견하고, 유영 형태는 운동과 관련이있다. 최근의 연구에 깃발들이 다공성 인터페이스에서 성숙 구조의 형성에 선구자 역할을 할 수 있습니다로, 다양한 자연과 인공 시나리오에서 폭 넓은 영향을 생물 의학 시스템에서 신속하고 치명적인 바이오 필름의 증식으로 이어질, 또한 상당한 플로우 기반을 일으킬 수 있다는 것을 보여 주었다 구조의 상호 작용 등 1,7-9. 바이오 필름의 깃발은 자주를 형성다공성 매체와 같은 N 복잡한 서식지. 다공성 미디어 환경의 이해 생물막 성장은 같은 CO 2 포집 11로 상황에서 잘 보어의 무결성을 유지하고 토양 12 모공의 막힘 생물학적 폐수 처리 (10)로 여러 가지 환경 및 산업 공정에 관련이있다. 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 형성을 관찰하는 것은 종종 의한 다공질의 불투명도에 도전 할 수 있습니다. 그들이 실시간 인 시츄 모니터링을 허용하는 이러한 상황에서, 마이크로 유체 기반 다공성 미디어 플랫폼은 매우 유리한 증명할 수있다. 마이크로 유체의 또 다른 장점은 단일 바이오 마이크로 유체 플랫폼에서 여러 생물 반응기를 구축하고 동시에 온라인으로 모니터링 및 / 또는 센서의 통합을 허용하는 능력이다. 하나의 장치 및 정확한 통계적 분석을 위해 상당한 관련 데이터를 수집하는 기능이 여러 실험실 실험을 구현하는 유연성 중요하다 ADV미세 유체 시스템 (13, 14)의 ANTAGE. 위 설명의 문맥에서, 다공성 매체 환경에서 이해 유영 형성 역학은 여러 응용에 유익 할 것이다. 본 연구에서는 본뜬 다공성 매체 장치에서 스 트리머 형성을 조사하는 프로토콜을 개발한다. 미세 유체 플랫폼의 제조는, 세포 배양과 실험에 필요한 단계가 설명되어 있습니다. 실험에서는, 슈도모나스 fluorescens의 야생형 균주 사용 하였다. P. 토양에서 자연적으로 fluorescens는 토양 생태 (15)을 유지에 중요한 역할을합니다. 사용 된 균주는 유전자 구성 적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 설계되었다.

<table><tbody><tr><td>Flourescent Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspend 40 g in 1 L of purified water</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>suspend 20 g in 1 L of purified water</td></tr><tr><td>Biosafety hood</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish</td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 incubator shaker series</td></tr><tr><td>50 ml sterilized centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polypropylene RNase-/DNase-free</td></tr><tr><td>Tetracycline free base</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &amp;#956;g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomer Base and curing agent</td></tr><tr><td>Positive photoresist (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars

몇몇 세균 종은 표면에 부착 생물막 불리는 박막의 형태로 이들을 정착 할 수있는 능력을 갖는다. 다공성 매체에서 성장 바이오 필름은 폐수 처리 및 CO 2 격리 등의 여러 산업 및 환경 프로세스에 적합하다. 우리는 모방 다공성 지지체를 미세 유체 장치에서 biofilm 형성을 조사하기 위해, 슈도모나스 fluorescens 그람 음성 호기성 세균을 사용했다. 미세 유체 장치는 소프트 리소그래피를 사용하여 제조 된 마이크로 게시물의 배열로 구성되어 있습니다. 그 후, 흐름이 장치에서 biofilm 형성을 조사하고, 우리는 우리의 장치 깃발로 알려진 사상 바이오 필름의 형성을 보여줍니다. 제조 및 미세 유체 장치의 조립을위한 상세한 프로토콜은 세균 배양 프로토콜과 함께 여기에 제공됩니다. 마이크로 유체 장치와 실험에 대한 자세한 절차는 담당자와 함께 제공됩니다결과.

상술 한 미세 프로토콜을 이용하여 PDMS 기반의 미세 유체 소자를 제작 하였다. 1 주 사형 전자 현미경 (SEM) PDMS의 이미지를 보여준다 장치.도 1a는 상기 장치의 입구 부분을 나타낸다. 포크 모양의 입구는 장치에서 압력 헤드를 동일하게 만들어집니다. 또한 SEM 영상은 기둥 벽 (그림 1b) 거의 수직 것으로 나타났다. 배양 균액 (도 2)로 희석시키고, 그?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars at JoVE.com

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.1K 조회수.  University of Alberta. Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated. 

비디오: Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

연구

면역학 및 감염병학

Fabrication and Visualization of Capillary Bridges in Slit Pore Geometry

A procedure for creating and imaging capillary bridges in slit-pore geometry is presented. High aspect ratio hydrophobic pillars are fabricated and functionalized to render their top surfaces hydrophilic. The combination of a physical feature (the pillar) with a chemical boundary (the hydrophilic film on the top of the pillar) provides both a physical and chemical heterogeneity that pins the triple contact line, a necessary feature to create stable long but narrow capillary bridges. The substrates with the pillars are attached to glass slides and secured into custom holders. The holders are then mounted onto four axis microstages and positioned such that the pillars are parallel and facing each other. The capillary bridges are formed by introducing a fluid in the gap between the two substrates once the separation between the facing pillars has been reduced to a few hundred micrometers. The custom microstage is then employed to vary the height of the capillary bridge. A CCD camera is positioned to image either the length or the width of the capillary bridge to characterize the morphology of the fluid interface. Pillars with widths down to 250 &#181;m and lengths up to 70 mm were fabricated with this method, leading to capillary bridges with aspect ratios (length/width) of over 1001.

A procedure for creating and imaging capillary bridges in slit-pore geometry is presented. The creation of capillary bridges relies on the formation of pillars to provide a directional physical and chemical heterogeneity to pin the fluid. Capillary bridges are formed and manipulated using microstages and visualized using a CCD camera.

슬릿 모공 기하학에서 모세관 다리의 제작 및 시각화

A procedure for creating and imaging capillary bridges in slit-pore geometry is presented. High aspect ratio hydrophobic pillars are fabricated and ...

공학

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

생체공학

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

환경과학

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

A Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media

Bacterial biofilms are found in several environmental and industrial porous media, including soils and filtration membranes. Biofilms grow under certain flow conditions and can clog pores, thereby redirecting the local fluid flow. The ability of biofilms to clog pores, the so-called bioclogging, can have a tremendous effect on the local permeability of the porous medium, creating a pressure buildup in the system, and impacting the mass flow through it. To understand the interplay between biofilm growth and fluid flow under different physical conditions (e.g., at different flow velocities and pore sizes), in the present study, a microfluidic platform is developed to visualize biofilm development using a microscope under externally-imposed, controlled physical conditions. The biofilm-induced pressure buildup in the porous medium can be measured simultaneously using pressure sensors and, later, correlated with the surface coverage of the biofilm. The presented platform provides a baseline for a systematic approach to investigate bioclogging caused by biofilms in porous media under flow conditions and can be adapted to studying environmental isolates or multispecies biofilms.

The present protocol describes a microfluidic platform to study biofilm development in quasi-2D porous media by combining high-resolution microscopy imaging with simultaneous pressure difference measurements. The platform quantifies the influence of pore size and fluid flow rates in porous media on bioclogging.

다공성 매체의 생물 막힘을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼

Bacterial biofilms are found in several environmental and industrial porous media, including soils and filtration membranes. Biofilms grow under certain ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

입자 추적 Microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

생물학

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...