이 작품은 NIH (NINDS)에서 RO1 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 주사 준비 바이러스 <ol><li> rAAVs은 권장 상업 공급 업체에서 구입한 있었으나, 그들은 또한 (아래 토론을 참조) 자신의 연구실에서 생산 수 있습니다. 바이러스 솔루션은 일반적으로 밀리리터 당 ~ 1x10 12 게놈 사본 (GC / ML)의 titer에서 생산하고 세포의 큰 숫자를 조작하는 전체 titer에서 사용할 수 있습니다. 또는, 그들은 스파스 라벨의 원하는 수준을 생산하는 희석 수 있습니다. 적절한 희석은 사용자에 의해 결정되어야합니다,하지만 1시 10분 희석을 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 사용하기 전에 즉시 얼음에 바이러스를 녹여. 소형 (~ 250μl) PCR 튜브에 바이러스 솔루션의 원하는 미리 희석 볼륨을 전송합니다. 조직 문화 후드의 살균 DPBS의 적절한 볼륨을 사용하여 바이러스 솔루션을 희석. 그것이 필요 때까지 얼음에 희석 바이러스 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 참고 : 모든 바이러스의 처리는 기관의 승인을 biosafety 프로토콜에 따라 실시되어야합니다 2. 주사기 로딩 및 장비 조립 <ol><li> 부드럽게 플런저를 당기는하여 유리 주사기로 로딩 바늘을 연결하여 PCR 튜브에서 바이러스 솔루션을 그립니다. 공기의 매우 작은 기포가 주사기에서 볼 수있을 때까지 플런저를 당겨,이 솔루션의 모든 주사기에 있으며 로딩 바늘에 남아되지 않았음을 나타냅니다. 또는 불활성 염료의 작은 금액이 표시되도록하기 위해 솔루션에 추가할 수 있습니다. 참고 : 작은 PCR 튜브가 로딩 바늘은 일반적으로 대부분의 다른 튜브의 바닥에 도달하는 정도로 그리 길지 않을 것이기로 사용해야합니다. </li><li> 로딩 바늘을 제거하고 주사기 리테이너로 확보, 주사기 펌프의 주사기 블록에 주사기를 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 주사기로 결합 튜브의 한쪽 끝을 삽입하고, 바늘 홀더에 다른 쪽 끝을 삽입합니다. 바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입합니다. 사출 바늘의 끝을 직접 바늘 홀더의 결합 튜브 내부의 끝을 문의하시기 바랍니다. </li><li> 천천히 결합 튜브를 통해 솔루션을 눌러 수동으로 플런저를 우울. 솔루션의 작은 방울이 분사 바늘의 끝에 표시됩니다 때까지 누르십시오. </li><li> 조심스럽게 푸셔 블록 옆에있는 플런저의 위치와 푸셔 블록 브래킷과 장소에 안전. </li><li> 사출 매개 변수를 설정 : 사출 속도는 약 8μl/min (~ 130nl / s)로한다, 주입 부피는 일반적으로 1 - 2ul되며이 (지침에 대한 주사기 펌프 설명서를 참조)를 사용하는 주사기의 크기에 해당하는 주사기의 직경을 선택합니다. </li><li> 열판을 설정 ~ 38 ° C 및 복구 단계에서 새끼를 보호하기 위해 종이 타월이나 얇은 장벽과 커버. </li></ol> 3. 사출 절차와 펍 복구 <ol><li> IACUC 승인된 프로토콜을 다음과 추위 마취에 쓰는하여 주사 P0 또는 P1 마우스 새끼를 준비합니다. 얼음 물 장소 몇 종이 타올을 저해할. 종이 타월 (그들이 잘 분리 보관)에 새끼의 원하는 숫자 (4-5)를 놓고 그들이 젖은 종이 타월이 적용되도록 부드럽게 새끼 위에 종이 수건을 접어. 부드럽게 종이 타올 위에 얼음 조각의 작은 금액을 넣고 약 5 분 동안 새끼를 부화. 새끼는 최대 15 분 동안 얼음에 보관하고 나중에 잘 복구할 수 있습니다. </li><li> 강아지가 충분히 anesthetized 후 장착 블록에 배치 (우리가 일반적으로 15ml 튜브를 가지고 스티로폼 블록을 사용) 및 사출 사이트에 최고의 접속을 위해 위치. 피질에 대한 그것은 소뇌에 대한 그것은 두개골의 뒤쪽에 더 나은 액세스를 제공하기 위해 블록의 가장자리 이상의 강아지 머리를 위치에 도움이되는 동안, 그 배꼽에있는 동물의 아파트를 마련하기 쉬운 것입니다. 원하는 경우 강아지는 반창고와 장소에 안전하게있을 수 있습니다. </li><li> 바늘이 수동으로 다른 손으로 원하는 사이트의 두개골을 통해 삽입하는 동안 한 손으로 장소에있는 강아지 머리를 잡아. 주입하는 동안 이동에서 그것을 방지하기 위해 피부가 꽉 끌어 도움이 그것입니다. 피질의 경우 이것이 미래의 주사에 도움이되므로, 같은 두개골의 람다 봉합으로 잘 정의된 해부의 랜드마크에 상대적인 주사를 확인하는 데 유용합니다. 소뇌는 조직이 colliculus 직접 꼬리 거짓말 얇은 스트립으로 두개골을 통해 볼 수 있습니다. 바늘을 삽입해야하는 깊이가 각각의 동물과 종자 사이에 약간 차이가 있으며 바늘에 미리 정해진 마커에 의해 gauged 수 있지만 피질과 소뇌에 대해 우리는 ~ 0.5의 깊이 발견 - 표면에서 1mm 일반적으로 적합합니다. 다른 사이트에 대한 삽입 깊이는 최종 사용자에 의해 실험적으로 결정되어야합니다. 참고 : 바늘이 쉽게 두개골을 관통해야한다 그렇지 않으면이 동물을 다칠 수로 너무 세게 누르지 마. 바늘 위치를 조정하고 부드럽게 다시 시도하십시오. </li><li> 바이러스 솔루션을 주사. 주입이 시작됩니다펌프에있는 시작 버튼을 누르면하거나 발을 페달을 우울, 인젝터는 사용 압력의 모델에 따라 의해 에드. 발 페달의 부재에서,이 동료는 주사에 영향을 미칠 수 불필요한 손 움직임을 최소화하기 위해 버튼을 누르면 도와하도록 권장합니다. </li><li> 선택한 볼륨이 주입되고 나면, 몇 초 동안 위치에 바늘을 유지하고 부드럽게 원활하게 그것을 슬라이딩하여 바늘을 제거합니다. 관계없는 움직임을 최소화하기 위해 자리에있는 강아지 머리를 잡아주십시오. 사출 장비 세척 및 소독 에탄올과 실험 사이의 상처가 작고 때문에, 살균의 사용은 불필요합니다. </li><li> ~ 38의 온도 설정으로 덮여 열판에 강아지를 놓고 ° C 복구, 일반적으로 50-10분 위해 따뜻하게합니다. 이 시간 동안 다른 새끼를 넣고 계속 사용할 수 있습니다. </li><li> 새끼 모든 회복 후에 (그들은 분홍색과 이동해야합니다) 홈 침구의 일부를 가지고 부드럽게 그것으로 새끼를 문지 르세요. 그룹으로 엄마와 새끼를 반환합니다. </li></ol> 참고 : 새끼가 엄마에게 반환하고 그룹으로 그들을 반환하기 전에 따뜻한 가정 침구에 노출되도록하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게하지 ​​않으면 새끼를 손상하거나 죽이는 어머니가 발생할 수 있습니다. 4. 장비 세척 <ol><li> 주입이 완료되고 새끼가 어미로 반환되었습니다 후, 완전히 아세톤 또는 70 % 에탄올로 주사기를 로딩하여 사출 설정을 청소하십시오. 신선한 솔루션 때마다을 사용하여 사출 설정 여러 번을 통해 솔루션을 플러쉬. 이것은 남아있는 바이러스 솔루션을 제거하고 precipitates 것입니다. 아세톤이나 에탄올 다음 증발됩니다. 참고 : 아세톤이 청소 선호하지만 설치가 같은 cyanoacrylate 접착제 같은 아세톤에 민감한 구성 요소를 사용하는 경우, 다음 단계에 대한 70 % 에탄올을 사용하는 것입니다. </li><li> 적절한 생물 학적 용기에 표백제 및 폐기 쓰레기와 작업 공간을 소독. </li></ol> 5. 분석 <ol><li> IACUC 승인 안락사 방법을 사용하여 원하는 나이에 동물을 희생. 재관류의 고정은 특히 성인 동물에 감염 뉴런, 이후 시각화에 도움을 권장합니다. </li><li> 표준 immunostaining 절차는 형광 신호를 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 간단히, vibratome 섹션을 떠 100 μm의는 PBS 1퍼센트 트리톤 X - 100 permeabilized 및 PBS 1% 트리톤 X - 100 10% 정상 염소 혈청으로 차단됩니다. 제 4에서 하룻밤 일차 항체 ° C, 세탁 및 차단 추가하여 다음과 솔루션을 차단에 incubated 수 있습니다. 섹션은 다음 상온에서 2 시간 동안 차 항체와 솔루션을 차단에 incubated 철저하게 씻어, 슬라이드에 장착 및 안티 페이드 설치 미디어 coverslipped 있습니다. Cryosections도 레이블 뉴런을 시각화하는 데 사용할 수있는, 그러나 내생 형광가 손실되었을 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 성공적인 분사 절차없이 관찰할 수있는 조직 손상이나 동물에서 다른 병에 효과와 주입 사이트의 영역에서 뉴런의 강력한 감염을 생산합니다. 그림 1에서 그림과 같이, 감염의 확산은 다양한 해부 사이트에 rAAV8 - Cre 호텔로 주입 Cre 호텔 - 기자 마우스 (ROSA26R) 12 볼 수 있습니다. 이러한 대뇌 피질과 우수한 colliculus과 같은 특정 지역에 주사는 일반적으로 인접 지역 (그림 1A - B)에 최소한의 확산과 지역 감염을 생성합니다. 높은 titer의 바이러스 솔루션의 사용 (그림 1A) 가능성이 더 높습 같은 해마와 같은 인접 지역의 감염을합니다. ROSA26R 기자 마우스 (그림 1C - D)의 정중선에서 rAAV8 - Cre 호텔의 소뇌 주입과 같이 일반적으로, 사출 현장 근처 남아 스파스 감염의 낮은 titer 바이러스 솔루션 결과와 사출. 우리는 기자의 유전자의 감염, 재조합, 그리고 표현식이 모두 상대적으로 빠르게 발생할 수 제안, rAAV8 - Cre 호텔의 주사 후 2 일 이내에 ROSA26R 기자 마우스의 재조합을 관찰했습니다. 또한, 우리가 성공적으로 floxed 조건부 allele를 사용하여 비 로사 로커스에서 유전자 삭제의 효과를 연구하기 위해이 기술을 사용한의 결과가 다른 게시됩니다. 감염된 세포의 숫자는 주입된 바이러스 솔루션의 titer와 상관 관계한다. 예를 들어, 소뇌에 서로 다른 형광 단백질을 표현하는 두 rAAV8 바이러스의 높은 titer 솔루션의 믹스를 주입하는 것은 differentially (그림 2A) 표시 여러 Purkinje 세포를 감염. 반대로, 낮은 titer 바이러스 솔루션을 주입하는 것은 하나의 세포 (그림 2B) 시각에 투입 스파스 감염이 발생할 수 있습니다. 찬란 분류 뉴런은 신선한 컷, 살아있는 조직 (그림 2B)에서 직접 관찰할 수있다 또는 넓은 필드 또는 공동으로 나중에 이미지 수집을위한 내생 형광 신호를 향상시키기 위해 immunostaining를 받게 될 수 있습니다n 초점 형광 현미경 (그림 2A, 그림. 3A - C). 마지막으로, rAAV8 잘 프로세스의 강력한 라벨 (그림 3A - C)와 피질의 신경 세포 유형의 다양한 감염이 가능합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> 그림 1 : P0에서 rAAV8 - Cre 호텔로 주입되었다 ROSA26R 기자 마우스의 두뇌에 LacZ의 얼룩은 Cre 호텔의 활동과 감염의 위치를 보여줍니다. <ol type="A"><li> 높은 titer (1x10 12 GC / ML) 피질과 우수한 colliculus로 주사를 보여주는 P14 두뇌의 넓은 분야 화살 볼 수 있습니다. 높은 titer의 바이러스의 사용은 인접 지역도 감염된다는 것이 더 가능성이 있습니다. </li><li> P14 피질의 화살 섹션은 바이러스가 확산 적은 비용으로 현지 감염을 보여줍니다 낮은 titer (1x10 11 GC / ML)로 주입. </li><li> 낮은 titer과 정중선 (1x10 9 GC / ML) 바이러스 솔루션에 주입 P28의 소뇌의 wholemount보기는 감염이 스파스이며 일반적으로 사출 현장 근처에서 유지 보여줍니다. </li><li> C에서 소뇌의 정중선의 화살보기). 일반적으로 전용 Purkinje 세포 rAAV8에 의해 감염됩니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> 그림 2 : 형광 단백질을 표현 rAAV8 높은 낮은 titers와 함께 주입하여 소뇌 라벨. <ol type="A"><li> EGFP (녹색) 및 DsRed (적색)을 표현하는이 바이러스의 혼합 감염 P21cerebellum의 화살 섹션을 참조하십시오. 바이러스의 높은 titer 믹스는 Purkinje 세포의 다수를 감염하는 데 사용되었다. </li><li> 매우 낮은 titer 바이러스 감염에서 살고 P14 소뇌의 purkinje 세포는 즉시 절개 후 몇 군데. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> 그림 3 : rAAV8 - DsRed하여 두피 라벨. P0에서 rAAV8 - DsRed에 의해 감염 P21 피질의 코로나 섹션에서 대뇌 피질의 신경 세포 유형의 다양한 예.

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	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 신생아 바이러스성 주입 방법은 출생 후의 두뇌 개발의 연구에 대한 생체내 모자이크에서 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다. 방법은뿐만 아니라 현재 프로젝트 6 타겟팅 높은 처리량 진을 통해 만들어지고있는 이들 사용할 수 있습니다 floxed 대립 형질을 활용합니다. Cre 호텔의 형질 표현의 사용에 비해이 방법은 floxed 대립 유전자를 가지고 생쥐가 실험에 직?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> rAAV8 - Cre 호텔, - GFP, - DsRed, </td><td> 벡터 Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, 맞춤 주문 </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> 하버드 펌프 11 플러스 </td><td> 하버드 장치 </td><td> # 702208 </td><td> (발이 페달 포트) </td></tr><tr><td> 망막 안료 상피 주입 키트 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> RPE - KIT </td><td> 결합 튜브, 사출 바늘 (36G), 그리고 바늘 홀더 포함 </td></tr><tr><td> NanoFil 주사기, 100μl </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> NANOFIL - 100 </td><td> 재사용 로딩 바늘 포함 </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP 항체 </td><td> 에이브스 </td><td> GFP - 1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed 항체 </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> 가열 블럭 </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

신경 회로가 성숙하고 세련된 때 정상 뇌 기능은 출생 후의 개발뿐만 아니라 주요의 연결 경로가 설정됩니다 배아 발달에 의존하지만. 이 단계에서 Misregulation는 자폐증과 정신 분열증의 1,2로 신경 및 정신 장애가 발생할 수 있습니다. 많은 유전자가 태아 뇌에서 공부하고 많은 발달 과정을 3-5으로 중요한 발견되었습니다. 그러나, 출생 후의 두뇌에서 기능은 생쥐에서 삭제가 자주 신생아 개발 중에 파괴 장면을 보여 주죠에 이르게 일부 있기 때문에, 그리고 초기 개발에 자신의 요구 사항이 출생 후의 분석을 초래할 일부 있기 때문에, 대부분 알 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하려면 유전자의 대립 유전자는 현재 floxed 생쥐 6 생성되고있다. 표현 Cre 호텔 recombinase는 특정 세포 종류에 조건부 삭제는 출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 연구하기 위해 얻을 수있는 유전자 변형 대립 유전자와 결합하는 경우. 그러나,이 방법은이를 마우스 두뇌의 규모에 유전자 분석의 확장을 제한, 추가 대립 유전자 및 여분의 시간 (3-6개월) 적절한 genotypes와 마우스를 생성해야합니다. 여기 우리는 출생 후의 두뇌 개발에 신속하게 그리고 체계적으로 이러한 floxed 대립 유전자 연구를 virally - Cre 호텔 표현을 사용하는 보완 방법을 보여줍니다. 신생아 두뇌에 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 7,8 인코딩 Cre 호텔을 주입함으로써, 우리는 두뇌의 다른 지역에 대한 관심의 유전자를 삭제할 수 있습니다. 바이러스 titer를 제어 및 형광 단백질 마커를 coexpressing함으로써, 우리는 동시에 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 분기와 기와뿐만 아니라 버렸네 형성 및 개선, 초기 개발에 많은 유전자의 요구를 무시하고, 우리 axonal 및 돌기의 성장을 포함하여 출생 후의 두뇌 개발에 많은 중요한 과정에서 세포 자율 기능을 공부하실 수 있습니다. 이 방법은 우리 자신의 연구실에서 (미발표 결과) 등 8,9에서 성공적으로 사용되었으며, 같은 lentivirus 9뿐만 아니라 shRNA 또는 지배 활성 단백질 10의 표현에 다른 바이러스에 확장될 수 있습니다. 또한, 전기 생리학이 기술을 결합뿐만 아니라 최근에 개발된 광학 이미징 도구 11,이 방법은 유전자 경로가 마우스 및 쥐의 신경 회로 개발과 기능에 영향을 미치는 방법을 연구하기 위해 새로운 전략을 제공합니다.

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

<em&gt; 생체내에</em출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 테스트하는&gt; 방법을 설명합니다. Cre 호텔 및 / 또는 형광 단백질을 표현하는 재조합 AAVs는 신생아 마우스 두뇌에 주입하고 있습니다. 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨이 신경 회로 개발에 중요한 공정에서 유전자 기능의 빠른 분석을 허용, 달성하고 있습니다.

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K 조회수.  Keck School of Medicine, University of Southern California.  생체내에 방법을 설명합니다. Cre 호텔 및 / 또는 형광 단백질을 표현하는 재조합 AAVs는 신생아 마우스 두뇌에 주입하고 있습니다. 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨이 신경 회로 개발에 중요한 공정에서 유전자 기능의 빠른 분석을 허용, 달성하고 있습니다.

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Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

연구

발생학

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

신경과학

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a powerful model system for the investigation of cell type-specific mechanisms of neuronal morphogenesis and connectivity. The organization and composition of retinal subtypes are well-defined, and genetic tools are available to access specific types during development. Many retinal cell types also constrain their dendrites and/or axons to narrow layers, which facilitates time-lapse imaging. Mouse retina explant cultures are well suited for live-cell imaging using confocal or multiphoton microscopy, but methods optimized for imaging dendrite dynamics with temporal and structural resolution are lacking. Presented here is a method to sparsely label and image the development of specific retinal populations marked by the Cre-Lox system. Commercially available adeno-associated viruses (AAVs) used here expressed membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner. Intraocular delivery of AAVs in neonatal mice produces fluorescent labeling of targeted cell types by 4-5 days post-injection (dpi). The membrane fluorescent signals are detectable by confocal imaging and resolve fine branch structures and dynamics. High-quality videos spanning 2-4 h are acquired from imaging retinal flat-mounts perfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF). Also provided is an image postprocessing pipeline for deconvolution and three-dimensional (3D) drift correction. This protocol can be used to capture several cellular behaviors in the intact retina and to identify novel factors controlling neurite morphogenesis. Many developmental strategies learned in the retina will be relevant for understanding the formation of neural circuits elsewhere in the central nervous system.

Here, we present a method for investigating neurite morphogenesis in postnatal mouse retinal explants by time-lapse confocal microscopy. We describe an approach for sparse labeling and acquisition of retinal cell types and their fine processes using recombinant adeno-associated virus vectors that express membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Visualizing Neuronal and Glial Cell Dynamics in the Developing Mouse Brain

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

저자 스포트라이트: Exploring Cell Migration and Gene Roles in the Developing Brain

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

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신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징