이 작품은 NIH (NINDS)에서 RO1 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 주사 준비 바이러스 <ol><li> rAAVs은 권장 상업 공급 업체에서 구입한 있었으나, 그들은 또한 (아래 토론을 참조) 자신의 연구실에서 생산 수 있습니다. 바이러스 솔루션은 일반적으로 밀리리터 당 ~ 1x10 12 게놈 사본 (GC / ML)의 titer에서 생산하고 세포의 큰 숫자를 조작하는 전체 titer에서 사용할 수 있습니다. 또는, 그들은 스파스 라벨의 원하는 수준을 생산하는 희석 수 있습니다. 적절한 희석은 사용자에 의해 결정되어야합니다,하지만 1시 10분 희석을 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 사용하기 전에 즉시 얼음에 바이러스를 녹여. 소형 (~ 250μl) PCR 튜브에 바이러스 솔루션의 원하는 미리 희석 볼륨을 전송합니다. 조직 문화 후드의 살균 DPBS의 적절한 볼륨을 사용하여 바이러스 솔루션을 희석. 그것이 필요 때까지 얼음에 희석 바이러스 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 참고 : 모든 바이러스의 처리는 기관의 승인을 biosafety 프로토콜에 따라 실시되어야합니다 2. 주사기 로딩 및 장비 조립 <ol><li> 부드럽게 플런저를 당기는하여 유리 주사기로 로딩 바늘을 연결하여 PCR 튜브에서 바이러스 솔루션을 그립니다. 공기의 매우 작은 기포가 주사기에서 볼 수있을 때까지 플런저를 당겨,이 솔루션의 모든 주사기에 있으며 로딩 바늘에 남아되지 않았음을 나타냅니다. 또는 불활성 염료의 작은 금액이 표시되도록하기 위해 솔루션에 추가할 수 있습니다. 참고 : 작은 PCR 튜브가 로딩 바늘은 일반적으로 대부분의 다른 튜브의 바닥에 도달하는 정도로 그리 길지 않을 것이기로 사용해야합니다. </li><li> 로딩 바늘을 제거하고 주사기 리테이너로 확보, 주사기 펌프의 주사기 블록에 주사기를 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 주사기로 결합 튜브의 한쪽 끝을 삽입하고, 바늘 홀더에 다른 쪽 끝을 삽입합니다. 바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입합니다. 사출 바늘의 끝을 직접 바늘 홀더의 결합 튜브 내부의 끝을 문의하시기 바랍니다. </li><li> 천천히 결합 튜브를 통해 솔루션을 눌러 수동으로 플런저를 우울. 솔루션의 작은 방울이 분사 바늘의 끝에 표시됩니다 때까지 누르십시오. </li><li> 조심스럽게 푸셔 블록 옆에있는 플런저의 위치와 푸셔 블록 브래킷과 장소에 안전. </li><li> 사출 매개 변수를 설정 : 사출 속도는 약 8μl/min (~ 130nl / s)로한다, 주입 부피는 일반적으로 1 - 2ul되며이 (지침에 대한 주사기 펌프 설명서를 참조)를 사용하는 주사기의 크기에 해당하는 주사기의 직경을 선택합니다. </li><li> 열판을 설정 ~ 38 ° C 및 복구 단계에서 새끼를 보호하기 위해 종이 타월이나 얇은 장벽과 커버. </li></ol> 3. 사출 절차와 펍 복구 <ol><li> IACUC 승인된 프로토콜을 다음과 추위 마취에 쓰는하여 주사 P0 또는 P1 마우스 새끼를 준비합니다. 얼음 물 장소 몇 종이 타올을 저해할. 종이 타월 (그들이 잘 분리 보관)에 새끼의 원하는 숫자 (4-5)를 놓고 그들이 젖은 종이 타월이 적용되도록 부드럽게 새끼 위에 종이 수건을 접어. 부드럽게 종이 타올 위에 얼음 조각의 작은 금액을 넣고 약 5 분 동안 새끼를 부화. 새끼는 최대 15 분 동안 얼음에 보관하고 나중에 잘 복구할 수 있습니다. </li><li> 강아지가 충분히 anesthetized 후 장착 블록에 배치 (우리가 일반적으로 15ml 튜브를 가지고 스티로폼 블록을 사용) 및 사출 사이트에 최고의 접속을 위해 위치. 피질에 대한 그것은 소뇌에 대한 그것은 두개골의 뒤쪽에 더 나은 액세스를 제공하기 위해 블록의 가장자리 이상의 강아지 머리를 위치에 도움이되는 동안, 그 배꼽에있는 동물의 아파트를 마련하기 쉬운 것입니다. 원하는 경우 강아지는 반창고와 장소에 안전하게있을 수 있습니다. </li><li> 바늘이 수동으로 다른 손으로 원하는 사이트의 두개골을 통해 삽입하는 동안 한 손으로 장소에있는 강아지 머리를 잡아. 주입하는 동안 이동에서 그것을 방지하기 위해 피부가 꽉 끌어 도움이 그것입니다. 피질의 경우 이것이 미래의 주사에 도움이되므로, 같은 두개골의 람다 봉합으로 잘 정의된 해부의 랜드마크에 상대적인 주사를 확인하는 데 유용합니다. 소뇌는 조직이 colliculus 직접 꼬리 거짓말 얇은 스트립으로 두개골을 통해 볼 수 있습니다. 바늘을 삽입해야하는 깊이가 각각의 동물과 종자 사이에 약간 차이가 있으며 바늘에 미리 정해진 마커에 의해 gauged 수 있지만 피질과 소뇌에 대해 우리는 ~ 0.5의 깊이 발견 - 표면에서 1mm 일반적으로 적합합니다. 다른 사이트에 대한 삽입 깊이는 최종 사용자에 의해 실험적으로 결정되어야합니다. 참고 : 바늘이 쉽게 두개골을 관통해야한다 그렇지 않으면이 동물을 다칠 수로 너무 세게 누르지 마. 바늘 위치를 조정하고 부드럽게 다시 시도하십시오. </li><li> 바이러스 솔루션을 주사. 주입이 시작됩니다펌프에있는 시작 버튼을 누르면하거나 발을 페달을 우울, 인젝터는 사용 압력의 모델에 따라 의해 에드. 발 페달의 부재에서,이 동료는 주사에 영향을 미칠 수 불필요한 손 움직임을 최소화하기 위해 버튼을 누르면 도와하도록 권장합니다. </li><li> 선택한 볼륨이 주입되고 나면, 몇 초 동안 위치에 바늘을 유지하고 부드럽게 원활하게 그것을 슬라이딩하여 바늘을 제거합니다. 관계없는 움직임을 최소화하기 위해 자리에있는 강아지 머리를 잡아주십시오. 사출 장비 세척 및 소독 에탄올과 실험 사이의 상처가 작고 때문에, 살균의 사용은 불필요합니다. </li><li> ~ 38의 온도 설정으로 덮여 열판에 강아지를 놓고 ° C 복구, 일반적으로 50-10분 위해 따뜻하게합니다. 이 시간 동안 다른 새끼를 넣고 계속 사용할 수 있습니다. </li><li> 새끼 모든 회복 후에 (그들은 분홍색과 이동해야합니다) 홈 침구의 일부를 가지고 부드럽게 그것으로 새끼를 문지 르세요. 그룹으로 엄마와 새끼를 반환합니다. </li></ol> 참고 : 새끼가 엄마에게 반환하고 그룹으로 그들을 반환하기 전에 따뜻한 가정 침구에 노출되도록하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게하지 ​​않으면 새끼를 손상하거나 죽이는 어머니가 발생할 수 있습니다. 4. 장비 세척 <ol><li> 주입이 완료되고 새끼가 어미로 반환되었습니다 후, 완전히 아세톤 또는 70 % 에탄올로 주사기를 로딩하여 사출 설정을 청소하십시오. 신선한 솔루션 때마다을 사용하여 사출 설정 여러 번을 통해 솔루션을 플러쉬. 이것은 남아있는 바이러스 솔루션을 제거하고 precipitates 것입니다. 아세톤이나 에탄올 다음 증발됩니다. 참고 : 아세톤이 청소 선호하지만 설치가 같은 cyanoacrylate 접착제 같은 아세톤에 민감한 구성 요소를 사용하는 경우, 다음 단계에 대한 70 % 에탄올을 사용하는 것입니다. </li><li> 적절한 생물 학적 용기에 표백제 및 폐기 쓰레기와 작업 공간을 소독. </li></ol> 5. 분석 <ol><li> IACUC 승인 안락사 방법을 사용하여 원하는 나이에 동물을 희생. 재관류의 고정은 특히 성인 동물에 감염 뉴런, 이후 시각화에 도움을 권장합니다. </li><li> 표준 immunostaining 절차는 형광 신호를 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 간단히, vibratome 섹션을 떠 100 μm의는 PBS 1퍼센트 트리톤 X - 100 permeabilized 및 PBS 1% 트리톤 X - 100 10% 정상 염소 혈청으로 차단됩니다. 제 4에서 하룻밤 일차 항체 ° C, 세탁 및 차단 추가하여 다음과 솔루션을 차단에 incubated 수 있습니다. 섹션은 다음 상온에서 2 시간 동안 차 항체와 솔루션을 차단에 incubated 철저하게 씻어, 슬라이드에 장착 및 안티 페이드 설치 미디어 coverslipped 있습니다. Cryosections도 레이블 뉴런을 시각화하는 데 사용할 수있는, 그러나 내생 형광가 손실되었을 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 성공적인 분사 절차없이 관찰할 수있는 조직 손상이나 동물에서 다른 병에 효과와 주입 사이트의 영역에서 뉴런의 강력한 감염을 생산합니다. 그림 1에서 그림과 같이, 감염의 확산은 다양한 해부 사이트에 rAAV8 - Cre 호텔로 주입 Cre 호텔 - 기자 마우스 (ROSA26R) 12 볼 수 있습니다. 이러한 대뇌 피질과 우수한 colliculus과 같은 특정 지역에 주사는 일반적으로 인접 지역 (그림 1A - B)에 최소한의 확산과 지역 감염을 생성합니다. 높은 titer의 바이러스 솔루션의 사용 (그림 1A) 가능성이 더 높습 같은 해마와 같은 인접 지역의 감염을합니다. ROSA26R 기자 마우스 (그림 1C - D)의 정중선에서 rAAV8 - Cre 호텔의 소뇌 주입과 같이 일반적으로, 사출 현장 근처 남아 스파스 감염의 낮은 titer 바이러스 솔루션 결과와 사출. 우리는 기자의 유전자의 감염, 재조합, 그리고 표현식이 모두 상대적으로 빠르게 발생할 수 제안, rAAV8 - Cre 호텔의 주사 후 2 일 이내에 ROSA26R 기자 마우스의 재조합을 관찰했습니다. 또한, 우리가 성공적으로 floxed 조건부 allele를 사용하여 비 로사 로커스에서 유전자 삭제의 효과를 연구하기 위해이 기술을 사용한의 결과가 다른 게시됩니다. 감염된 세포의 숫자는 주입된 바이러스 솔루션의 titer와 상관 관계한다. 예를 들어, 소뇌에 서로 다른 형광 단백질을 표현하는 두 rAAV8 바이러스의 높은 titer 솔루션의 믹스를 주입하는 것은 differentially (그림 2A) 표시 여러 Purkinje 세포를 감염. 반대로, 낮은 titer 바이러스 솔루션을 주입하는 것은 하나의 세포 (그림 2B) 시각에 투입 스파스 감염이 발생할 수 있습니다. 찬란 분류 뉴런은 신선한 컷, 살아있는 조직 (그림 2B)에서 직접 관찰할 수있다 또는 넓은 필드 또는 공동으로 나중에 이미지 수집을위한 내생 형광 신호를 향상시키기 위해 immunostaining를 받게 될 수 있습니다n 초점 형광 현미경 (그림 2A, 그림. 3A - C). 마지막으로, rAAV8 잘 프로세스의 강력한 라벨 (그림 3A - C)와 피질의 신경 세포 유형의 다양한 감염이 가능합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> 그림 1 : P0에서 rAAV8 - Cre 호텔로 주입되었다 ROSA26R 기자 마우스의 두뇌에 LacZ의 얼룩은 Cre 호텔의 활동과 감염의 위치를 보여줍니다. <ol type="A"><li> 높은 titer (1x10 12 GC / ML) 피질과 우수한 colliculus로 주사를 보여주는 P14 두뇌의 넓은 분야 화살 볼 수 있습니다. 높은 titer의 바이러스의 사용은 인접 지역도 감염된다는 것이 더 가능성이 있습니다. </li><li> P14 피질의 화살 섹션은 바이러스가 확산 적은 비용으로 현지 감염을 보여줍니다 낮은 titer (1x10 11 GC / ML)로 주입. </li><li> 낮은 titer과 정중선 (1x10 9 GC / ML) 바이러스 솔루션에 주입 P28의 소뇌의 wholemount보기는 감염이 스파스이며 일반적으로 사출 현장 근처에서 유지 보여줍니다. </li><li> C에서 소뇌의 정중선의 화살보기). 일반적으로 전용 Purkinje 세포 rAAV8에 의해 감염됩니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> 그림 2 : 형광 단백질을 표현 rAAV8 높은 낮은 titers와 함께 주입하여 소뇌 라벨. <ol type="A"><li> EGFP (녹색) 및 DsRed (적색)을 표현하는이 바이러스의 혼합 감염 P21cerebellum의 화살 섹션을 참조하십시오. 바이러스의 높은 titer 믹스는 Purkinje 세포의 다수를 감염하는 데 사용되었다. </li><li> 매우 낮은 titer 바이러스 감염에서 살고 P14 소뇌의 purkinje 세포는 즉시 절개 후 몇 군데. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> 그림 3 : rAAV8 - DsRed하여 두피 라벨. P0에서 rAAV8 - DsRed에 의해 감염 P21 피질의 코로나 섹션에서 대뇌 피질의 신경 세포 유형의 다양한 예.

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	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 신생아 바이러스성 주입 방법은 출생 후의 두뇌 개발의 연구에 대한 생체내 모자이크에서 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다. 방법은뿐만 아니라 현재 프로젝트 6 타겟팅 높은 처리량 진을 통해 만들어지고있는 이들 사용할 수 있습니다 floxed 대립 형질을 활용합니다. Cre 호텔의 형질 표현의 사용에 비해이 방법은 floxed 대립 유전자를 가지고 생쥐가 실험에 직?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> rAAV8 - Cre 호텔, - GFP, - DsRed, </td><td> 벡터 Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, 맞춤 주문 </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> 하버드 펌프 11 플러스 </td><td> 하버드 장치 </td><td> # 702208 </td><td> (발이 페달 포트) </td></tr><tr><td> 망막 안료 상피 주입 키트 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> RPE - KIT </td><td> 결합 튜브, 사출 바늘 (36G), 그리고 바늘 홀더 포함 </td></tr><tr><td> NanoFil 주사기, 100μl </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> NANOFIL - 100 </td><td> 재사용 로딩 바늘 포함 </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP 항체 </td><td> 에이브스 </td><td> GFP - 1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed 항체 </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> 가열 블럭 </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

신경 회로가 성숙하고 세련된 때 정상 뇌 기능은 출생 후의 개발뿐만 아니라 주요의 연결 경로가 설정됩니다 배아 발달에 의존하지만. 이 단계에서 Misregulation는 자폐증과 정신 분열증의 1,2로 신경 및 정신 장애가 발생할 수 있습니다. 많은 유전자가 태아 뇌에서 공부하고 많은 발달 과정을 3-5으로 중요한 발견되었습니다. 그러나, 출생 후의 두뇌에서 기능은 생쥐에서 삭제가 자주 신생아 개발 중에 파괴 장면을 보여 주죠에 이르게 일부 있기 때문에, 그리고 초기 개발에 자신의 요구 사항이 출생 후의 분석을 초래할 일부 있기 때문에, 대부분 알 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하려면 유전자의 대립 유전자는 현재 floxed 생쥐 6 생성되고있다. 표현 Cre 호텔 recombinase는 특정 세포 종류에 조건부 삭제는 출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 연구하기 위해 얻을 수있는 유전자 변형 대립 유전자와 결합하는 경우. 그러나,이 방법은이를 마우스 두뇌의 규모에 유전자 분석의 확장을 제한, 추가 대립 유전자 및 여분의 시간 (3-6개월) 적절한 genotypes와 마우스를 생성해야합니다. 여기 우리는 출생 후의 두뇌 개발에 신속하게 그리고 체계적으로 이러한 floxed 대립 유전자 연구를 virally - Cre 호텔 표현을 사용하는 보완 방법을 보여줍니다. 신생아 두뇌에 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 7,8 인코딩 Cre 호텔을 주입함으로써, 우리는 두뇌의 다른 지역에 대한 관심의 유전자를 삭제할 수 있습니다. 바이러스 titer를 제어 및 형광 단백질 마커를 coexpressing함으로써, 우리는 동시에 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 분기와 기와뿐만 아니라 버렸네 형성 및 개선, 초기 개발에 많은 유전자의 요구를 무시하고, 우리 axonal 및 돌기의 성장을 포함하여 출생 후의 두뇌 개발에 많은 중요한 과정에서 세포 자율 기능을 공부하실 수 있습니다. 이 방법은 우리 자신의 연구실에서 (미발표 결과) 등 8,9에서 성공적으로 사용되었으며, 같은 lentivirus 9뿐만 아니라 shRNA 또는 지배 활성 단백질 10의 표현에 다른 바이러스에 확장될 수 있습니다. 또한, 전기 생리학이 기술을 결합뿐만 아니라 최근에 개발된 광학 이미징 도구 11,이 방법은 유전자 경로가 마우스 및 쥐의 신경 회로 개발과 기능에 영향을 미치는 방법을 연구하기 위해 새로운 전략을 제공합니다.

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

<em&gt; 생체내에</em출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 테스트하는&gt; 방법을 설명합니다. Cre 호텔 및 / 또는 형광 단백질을 표현하는 재조합 AAVs는 신생아 마우스 두뇌에 주입하고 있습니다. 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨이 신경 회로 개발에 중요한 공정에서 유전자 기능의 빠른 분석을 허용, 달성하고 있습니다.

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K 조회수.  Keck School of Medicine, University of Southern California.  생체내에 방법을 설명합니다. Cre 호텔 및 / 또는 형광 단백질을 표현하는 재조합 AAVs는 신생아 마우스 두뇌에 주입하고 있습니다. 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨이 신경 회로 개발에 중요한 공정에서 유전자 기능의 빠른 분석을 허용, 달성하고 있습니다.

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Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

연구

신경과학

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Magnetoencephalography를 사용 하 여 아이 들에 있는 두뇌 기능을 공부

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

일반적인 마모 셋에 전체 피 질 Electrocorticographic 배열의 만성 이식

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...