저자들은 기꺼이이 프로토콜이 개발되었다 시간 동안 지원 남부 캘리포니아 대학에서 교수 안드레아 아르마니을 인정합니다. 이 작품의 초기 개발을위한 기금은 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 제공되었다 [085,281 및 1,028,440]와 NIH 원장의 새로운 혁신 보너스 프로그램을 통해 건강의 국립 연구소 [1DP2OD007391-01]. 자세한 내용은에서 구할 수있다 <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. 배경 비오틴은 간단한 3 단계 과정 (그림 1)를 통해 이러한 장치의 표면에 붙어있다. 첫째, 우리는 표면을 청소하고 산소 플라즈마 또는 고생 솔루션 중 하나에 장치를 노출하여 히드록실 그룹과 그것을 채웁니다. 둘째, 우리는 가수 분해와 축합 반응을 통해 히드록실 그룹에 일차 아민과 종료 실란 커플링 에이전트를 장착 증기 증착법을 사용합니다. 셋째, 우리는 N-hydroxysuccinimide (보건국) 에스테르 화학을 통해 표면에 비오틴을 첨부합니다. 우리는이 기술을 이용해 주셔서 더욱 이러한 기술의 발전에 대한 정보뿐만 아니라, 우리의 동기에 대한 설명에 대한 우리의 이전 작업에 관심있는 독자를 안내할 8. 이러한 반응의 성공뿐만 아니라, 비오틴의 추가 후 일차 아민의 추가 후 광학 및 형광 현미경을 통해 평가할 수있다. 동안 광학 m표면 작용화 프로토콜도 microsphere 표면, 또는 오염 물질의 손상이 발생한 경우 icroscopy를 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 형광 현미경은 비오틴 분자의 표면 커버 리지의 품질과 균일를 확인하는 데 사용뿐만 아니라, 비오틴의 기능에있다 표면 (strept) 아비딘으로 바인딩합니다. 표면에 아민의 범위를 평가하기 위해, 우리는 microsphere에 안정적이고 공유 결합 티오 우레아 연계를 형성하는 데 일차 아민과 반응 플루오​​레신 isothiocyanate (FITC) 형광 염료을 사용 하였다. 아비딘으로 복합되었습니다 텍사스 적색 형광 염료는 비오틴 - 아비딘 상호 작용을 통해 표면에 비오틴 그룹 레이블을 지정하는 데 사용됩니다. 두 경우 염료가 그 표면에 기능성 그룹과 (수용체 - 리간드 상호 작용이나 공유 결합 본딩 중 통해) 상호 작용할 수 선정되었습니다. 여기 세 떠나 단체와 하나 기능성 그룹을 가진 실란 커플링 에이전트, 다리 베팅을 제공합니다무기 표면 및 유기 프로브 분자를 기대하다. 일차 아민 기능은 안정적인 아미드 유대 관계를 형성 보건국의 에스테르와 정량적 반응. 이 경우, 우리는 누구의 발레르 사이드 체인 NHS 에스테르 그룹과 수정되었습니다 비오틴 프로브 분자를 사용합니다. 현실에 어떠한 프로브 분자는 NHS 에스테르 그룹은 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 표면에 추가할 수 있습니다. 또한 이러한 프로토콜은 일반적이며, 비오틴과 함께 모든 실리카 장치 표면을 functionalize하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜과 주요 과제는 오히려 실리카 microspheres의 처리에 화학 자체가 사실이 아닙니다. 프로토콜에 걸쳐, microspheres는 날카로운 스쳐 핀셋으로 가볍게 자신의 줄기를 grapsing에 의해 다루어 져야합니다, 양해해 주시기 바랍니다. 이것은 아주 멀리 microspheres 자체에서 족집게를 유지하고, 단계 사이에 쉽게 전송을 허용합니다. 아래의 프로토콜의 많은 단계가 구체적으로이 사실에 대응하도록 고안되었습니다또는. 2. Microsphere의 제조 <ol><li> microspheres를위한 스토리지 주택을 빌드합니다. <ol><li> 이것은 일반적인 크기의 유리 슬라이드에 테이프를하며 끝을 롤을 형성 충족과 함께 스카치 테이프 부분에 1을 첨부, exacto 나이프 사용하여 사각형에 X 1의 1에 골판지의 두께 조각의 ¼ 잘라 , 골판지 있습니다. </li><li> 이것은 microsphere가 주변 환경에서 상승과 격리 수있는 플랫폼을 만들고, 그들의 표면에 손상을 방지할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 가위를 사용하여 광섬유의 스풀에서 광섬유의 3 인치 부분을 절단. </li><li> 아 - 닉 섬유 - 리퍼를 사용하여 바로 실리카 코어를 떠나, 섬유의 절단 부분의 끝 부분의 마지막 0.5 인치로부터 보호 고분자 코팅을 벗겨. Kimwipe로 남아있는 폴리머의 표면을 깨끗이 부드럽게 Kimwipe과 섬유질을 닦아하여 메탄올과 dampened. </li><li> 베어 섬유 식칼 사용 송두리째 끝을 이렇게 잘라 일불과 1에서 송두리째 섬유 mm은 섬유의 끝 부분에 남아 있습니다. </li><li> 수직으로 갔지만 끝이 아래로 향하게되는 등 섬유를 정렬하기 위해 간병, CO 2 레이저의 경로로 광학 섬유를 벗기고 끝부분을 놓습니다. </li><li> CO 2 레이저를 켜고 광학 섬유의 옷을 벗긴 끝 표면에 직접. 레이저 2 초 약 3.5 %의 전력을 사용하여 둥근 모양으로 섬유를 벗기고 끝을 녹여 것입니다. </li><li> 족집게 사용 microsphere의 줄기를 (광섬유의 비 막았죠 부​​분) 신중을 파악. microsphere 주택에 테이프 롤로 줄기를 연결합니다. 유리 슬라이드는 배양 접시에 자신을 저장할 수 있습니다. 이것은 microsphere의 안전한 보관을 허용합니다. </li></ol> 3. 히드록실 그룹으로 표면을 채우지 <ol><li> 고생 솔루션을 사용 : <ol><li> 힌지 캡과 60 ML의 폴리 프로필렌의 약병에서 H를 발연 량으로 (70:30을 고생 솔루션을 준비 <sub&gt; 2 SO 4 : 황산 발연의 11.6 ML 다음, 유리병에 과산화수소 5 ML를 추가하여 H 2 O 2 (30 wt %)를.) 주의 : 산성 방지 장갑을 착용하십시오. </li><li> 유리병에, 최소한 1 microsphere를 개최, 유리 슬라이드를 전송합니다. microsphere는 액체와 접촉에 있어야하지만, 액체가 마분지를 만지지 않습니다. 필요한 경우 솔루션의 볼륨을 조정합니다. </li><li> 부드럽게 유리병의 유리 덮개를 제거하고 DDI H 2 O를 포함하는 다른 플라스틱 약병에 삽입 샘플 5 분간 용액에 앉아 보자. </li><li> 부드럽게 유리병의 유리 슬라이드를 제거하고, 80시 10 분 ° C가 표면을 건조하기 위해 오븐에 넣으십시오. </li></ol></li><li> 산소 플라즈마 처리를 사용 : <ol><li> 산소 플라즈마 챔버에 적어도 하나의 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 200 mTorr의 산소 압력과 전력 120 W에 2 마일을 위해 산소 플라즈마에 시료를 폭로를 설정이야기야. </li><li> 플라즈마 챔버에서 유리 슬라이드를 제거합니다. </li></ol></li></ol> 4. 표면에 실란 커플링 에이전트를 부착 <ol><li> 퓸 배출 후드의 진공 건조기에 적어도 하나의 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를, 놓으십시오. </li><li> 또한 연기 후드에 실란 커플링 에이전트 병 (이 경우, aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)가 사용되었다) 연 건조기에서 열린 병을 놓습니다. </li><li> 진공 건조기에 뚜껑을 교체하고, 흡인기이나 집 진공 라인에 아울렛 포트를 연결합니다. </li><li> 집 진공 또는 물 라인 켜고 진공 건조기에서 철수. 진공 밀봉은 뚜껑과 받침대 사이에 형성되면 반응 타이밍을 시작합니다. 이것은 박막 등의 표면에 실란 커플링 에이전트를 입금합니다. </li><li> 십오분 후 진공을 해제하고, 천천히 건조기에 공기를하도록 포트를 엽니다. 이 커플링 에이전트의 경우 15 분 unifo를 형성​​하기에 충분표면 RM 단일층. 다른 커플링 요원의 경우 시간 조정해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 5. 표면에 비오틴을 부착 <ol><li> 한 시간 정도 비오틴을 부착하기 전에 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병에 무수 dimethylsulfoxide (DMSO)에 N-hydroxylsuccinimide 비오틴 (NHS-비오틴)의 10 MM 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 보건국-비오틴은 차가운 저장 되었다면, 그것을 조직하고 전에 실온에 평형 수 있습니다. </li><li> 완전히 용매에 보건국-비오틴 분말을 용해하기 위해 1 시간 정도 솔루션을 Sonicate. </li></ol></li><li> 하단에있는 microspheres와 다른 플라스틱 약병에 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를 전송하고, 약병의 상단 때문이다. </li><li> 유리 슬라이드 (그것은 유리병에 추가되고 있기 때문에 솔루션 microsphere를 만지지 않는다) 뒤에 유리병의 측면 아래로 플라스틱 pipet, 보건국-비오틴 솔루션의 적절한 볼륨을 사용하여 전송.microsphere 표면을 충당할 DD 충분한 솔루션입니다. </li><li> 각각, 5 rpm을 5 도에서 속도와 기울기의 각도로, 실온에서 30 분간 이제 요동 인큐베이터에 DMSO 용액에 microspheres 및 보건국-비오틴이 포함된 유리병 (틸트 트레이)를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 DDI H 2 O에 가득 다른 유리병으로 밀어 이전과 동일한 속도와 기울기 각도에서 또 다른 10 분 틸트 트레이에 병을 놓습니다. 신선한 물로 두 번 할 때마다이 단계를 반복합니다. 이것은 표면에서 과잉 DMSO를 제거하는 데 도움이, 그리고 표면 실제로 그라 프트 아니 신체적-adsorbed 비오틴을 제거합니다. </li><li> 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 모든 물방울이 표면에서 제거됩니다 ° C에서 10 분, 또는 때까지 80에서 오븐에 넣습니다. </li></ol> 6. 아민 - 종료 실리카의 형광 라벨링 <ol><li> treatm 후 현재 아민 그룹 레이블을 지정하려면APTMS있는 엔트는 1, ML 무수 DMSO에 1 밀리그램 FITC을 해소하여 어두운 방에 FITC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 0.1 M 나트륨 중탄산염 버퍼 1 ML에 FITC 용액의 50 μL를 추가하여 6.1의 솔루션을 희석. </li><li> 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병에 솔루션을 놓고 부드럽게 유리병에 유리 슬라이드에 다시 보관되어 아민-종료될 microspheres를, 슬라이드. </li><li> 얼음 욕조에 병을 놓고 예제는 어둠 속에서 4 시간 최소 FITC 솔루션으로 반응하자. </li><li> 나트륨 탄산 버퍼에 microspheres의 두 십분 물에 빨고 통해 초과 형광단를 제거합니다. 이전으로 버퍼와 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병을 입력하고 부드럽게 솔루션에만 microsphere, 그리고 마분지 주택을 커버한다는 돌보는 솔루션에 유리 슬라이드를 밀어. 알루미늄 포일로 병을 커버, 그리고 이전처럼 5도 5 rpm으로 설정 틸트 트레이에 병을 놓습니다. </li><li> 부드럽게 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 DDI H 2 O로 가득한 알루미늄 포일로 덮여 다른 유리병으로 밀어. 이전과 동일한 속도와 기울기 각도에서 또 다른 10 분 틸트 트레이에 병을 놓습니다. 신선한 물로 두 번 할 때마다이 단계를 반복합니다. 이것은 표면에서 여분의 염료를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 부드럽게 이미징 전에 10 분 80 C에서 설정 오븐에서 약병에서 유리 슬라이드를 제거하고 건조. </li></ol> 7. 비오틴 - 종료 실리카의 형광 라벨링 <ol><li> 인산염의 텍사스 - 레드 아비딘 중 10 μg / ML 솔루션을 준비는 염분 버퍼. </li><li> 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병에 솔루션을 추가하고 부드럽게 microsphere 방금 솔루션이 적용되어 있도록 솔루션으로 비오틴 - 종료 microsphere를 포함하는 유리 슬라이드를 밀어. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 30 분간 반응. </li><li> 이를 통해 초과 형광단 제거, 10 분 린스PBS 버퍼에 microspheres의의. <ol><li> 이전으로 버퍼와 힌지 캡과 함께 60 ML의 폴리 프로필렌의 유리병을 입력하고 부드럽게 솔루션에만 microsphere, 그리고 마분지 주택을 커버한다는 돌보는 솔루션에 유리 슬라이드를 밀어. </li><li> 알루미늄 포일로 병을 커버, 그리고 이전처럼 5도 5 rpm으로 설정 틸트 트레이에 병을 놓습니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 DDI H 2 O로 가득한 알루미늄 포일로 덮여 다른 유리병으로 밀어. 이전과 동일한 속도와 기울기 각도에서 또 다른 10 분 틸트 트레이에 병을 놓습니다. 신선한 물로 두 번 할 때마다이 단계를 반복합니다. 이것은 표면에서 여분의 염료를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 부드럽게 80에서 설정된 오븐 ° C 이미징 전에 10 분 안에 유리병에서 유리 슬라이드를 제거하고 건조. </li></ol> 8. 대표 결과 올바르게 기능화 microsphere들 광학 및 형광 현미경을 통해 확인할 수 있습니다. 표면 작용화이 올바르게 완료되면, 그것은 표면에 비오틴 분자의 균일 치밀한 취재 결과를해야하며 표면은 남아 결함 및 오염 물질이없는 작용화 후 검출 실험을하는 동안 그들의 높은 감성을 유지하기 위해. 광학 현미경은 형광 현미경은 표면 범위의 품질과 균일을 알아내기 수있는 반면, 후자를 알아내기 위해 사용될 수 있습니다. 그림 2에서 우리는 제대로 기능화 microspheres의 예를 보여줍니다. 이러한 이미지는 microspheres는 표면에 아민 그룹 (그림 2B) 또는 비오틴 그룹 (그림 2C) 중 하나의 유니폼, 일관된 커버 리지를 표시한다는 표면 손상 또는 작용화 (그림 2A)에 의한 오염이 없다는 것을 표시하고, . microspheres가 올바르게 기능화되지 않은 경우, 광학 microsphere 이미지 WI표면 오염, clumping 또는 비 균일한 커버 리지 및 표면 크랙과 같은 표면에 명백한 결함을, (그림 3) 전시하겠습니다. 여기서는 표면에 시약의 clumping으로 인한 표면 오염 물질의 일반적인 예제를 참조하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> 그림 1. 실리카 microspheres의 표면에 프로브 분자를 부착 3 단계의 반응 방식. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> 그림 2. 실리카 microspheres. 실리카 microsphere의) 광학 현미경은 산소 플라즈마에 노출을 통해 히드록실 그룹과 인구, b)는 실리카 microsphere의 형광 현미경은 일차 아민으로 채워집와 FITC 염료로 분류, 실리카 MI의 C) 형광 현미경crosphere은 비오틴으로 채워집 텍사스 레드 - 아비딘 켤레축으로 표시. Soteropulos의 허가 재판, CE, 헌트, 홍콩 및 알마니는 속삭이는 갤러리 모드 microcavities를 사용하여 바인딩 속도론의 결정 오전. Appl 있습니다. Phys. 레트 사람. 99 103703-103703 (2011). 저작권 2011, 물리학의 미국 학회. 17 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> 그림 3. 부적절 기능화 영역의 광학 현미경. 여기에서 오른쪽 상단 표면에 먼지를 볼뿐만 아니라 오염 표면을 연장하실 수 있습니다. 또한, 광학 microsphere의 오른쪽 측면 표면에 작은 잔디를 보여줍니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

프로토콜에 설명한 바와 같이, 우리가하는 작용화 과정 내내 자신의 줄기에 의해 실리카 microspheres의 수송을 주택 플랫폼을 만들었습니다. 이 주택 플랫폼 작용화 과정 전반에 걸쳐 사용되는 각종 용기의 벽면과 접촉으로 오는 microsphere에서 발생한 표면 오염 및 손상에 대한 솔루션으로 만들었습니다. 우리는 끊임없이 작용화 과정에서 다른 컨테이너로 개별 microspheres를 장착하고 분리에서 발생한...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 어부 </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS 학년 </td></tr><tr><td> 황산 </td><td> 어부 </td><td> 8014-95-7 </td><td> 발연 </td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> 어부 </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30 wt %의 </td></tr><tr><td> Aminopropyltrimethoxysilane </td><td> 어부 </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> 보건국-비오틴 EZ의 링커 </td><td> 찌르다 </td><td> 20,217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> 어부 </td><td> 67-68-5 </td><td> 무수의 </td></tr><tr><td> 플루오레신 Isothiocyanate </td><td> 찌르다 </td><td> 46,425 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> 어부 </td><td> 7647-14-5 </td><td> 분말 농축 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 버퍼 </td><td> 어부 </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> 텍사스 레드 - 아비딘 결합하다 </td><td> 찌르다 </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 </td><td> 뉴 포트 </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 스트리퍼 </td><td> 섬유 악기 판매 </td><td> NN-175 </td><td> 노 닉 175 음 스트리퍼 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> 어부 </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> 베어 섬유 클리버 </td><td> Ilsintech </td><td> CL-03A </td><td></td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 프로필렌 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 ML, 힌지 캡 </td></tr><tr><td> 로커를 잠복기 </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 건조기 </td><td> 어부 </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

attaching biological probes to silica optical biosensors using silane coupling agents

이러한 인기 Biacore 시스템 (표면 Plasmon 공명 (SPR) 기술을 기반으로)와 같은 생물 학적 환경, 바이오 센서 플랫폼과 인터페이스하기 위해, 예를 들면, 표면 오염을 방지 수있는 다양한 표면 변형 기법 사용을 만들 조정 소수성 / 표면의 친수성, 전자 환경의 다양한 적응, 그리고 자주, 관심의 대상으로 특이성을 유도. 1-5 이러한 기법 등, 복잡한 환경에서 실제 응용 프로그램에 달리 매우 민감한 biosensors의 기능을 확장할 수 혈액, 소변, 폐수 분석. 2,6-7은 같은 Biacore와 같은 상업 biosensing 플랫폼, 잘 이해하고 있지만로서, 이러한 표면 개조를 수행하기위한 표준 기술은 이러한 기술은 다른 표준화된 방식으로 번역되지 않은 레이블 - 이러한 갤러리 모드 (WGM) 광학 resonators 글린 등 무료 biosensing 플랫폼. 8-9은 &lt;<html> / P&gt; WGM 광학 resonators는 초저 농도의 종 다양한 라벨 프리 검출을 수행하기위한 유망한 기술을 대표하는 6,10-12 이러한 플랫폼의 높은 감도 자신의 독특한 기하학적 광학의 결과입니다. WGM 광학 resonators 경계가 순환 . 구체적이고 필수적인 공진 주파수의 빛을 SPR 플랫폼처럼 13, 광학 필드가 완전히 센서 장치에 국한되지 않지만 evanesces;이 &quot;사라져가는 꼬리&quot;는 다음 주변 환경의 수종과 상호 작용할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 약간 그 결과 변경하는 광학 분야의 효과적인 굴절률을 초래하지만, 감지, 장치의 공진 주파수로 이동합니다. 광학 필드 순환 때문에 신호의 고유 증폭 그 결과 환경을 여러 번 상호 작용, 그리고 환경의 사소한 변화에 매우 높은 감성. 2,14-15 십t &quot;&gt; WGM 광학 resonators는 여러 가지 형상으로 가공 수 있지만 복잡한 환경에서 타겟으로 탐지를 수행하려면 다음 플랫폼은 표면의 수정을 통해 프로브 분자 (결합 쌍 보통 절반, 예를 들어 항체 / 항원) 2.와 결합해야부터 재료 시스템의 다양한 실리카 microsphere는 가장 일반적입니다.이 microspheres은 일반적으로 microspheres가 작용화 및 검출 실험을하는 동안 처리할 수있는가 &quot;줄기&quot;를 제공하는 광섬유의 끝단에 가공하고 있습니다. 실리카 표면 화학 수 있습니다 그들의 표면에 프로브 분자를 장착 적용할 수 있지만, 평면 기판에 대해 생성된 전통적인 기법이 입체 구조를 위해 종종 충분하지 않습니다로서 microspheres의 표면에 어떠한 변경 사항 (먼지, 오염, 표면 결함, 그리고 고르지 코팅) 그들의 검출 능력에 대한 심각한, 부정적인 결과를 가질 수 있습니다. 여기서는 손쉬운 접근 방식을 보여주는실리카 표면에 비오틴을 첨부하여, 무기 표면 및 생물 학적 환경을 해소하기 위해 실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 microsphere WGM 광학 resonators의 표면 작용화입니다. 8,16 우리가이 리포트에서 센서 시스템으로 실리카 microsphere의 WGM의 resonators를 사용하지만, 프로토콜은 일반적이며, 비오틴과 함께 모든 실리카 장치의 표면을 functionalize하는 데 사용할 수 있습니다.

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Biosensors은 복잡한 생물 학적 환경과 인터페이스 및 표면 변형을 통해 센서에 부착된 매우 구체적인 프로브와 고감도 센서를 결합하여 타겟 검색을 수행합니다. 여기서는 센서 및 생물 학적 환경을 해소하기 위해 실란 커플링 에이전트를 이용하여 비오틴과 실리카 광 센서의 표면 작용화를 보여줍니다.

실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 Biosensors에 생물 학적 프로브를 부착

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K 조회수.  University of Missouri. Biosensors은 복잡한 생물 학적 환경과 인터페이스 및 표면 변형을 통해 센서에 부착된 매우 구체적인 프로브와 고감도 센서를 결합하여 타겟 검색을 수행합니다. 여기서는 센서 및 생물 학적 환경을 해소하기 위해 실란 커플링 에이전트를 이용하여 비오틴과 실리카 광 센서의 표면 작용화를 보여줍니다.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Biodissolvable 접착제가 부착 된 강성 보강재를 사용하여 유연한 신경 프로브의 삽입

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

광대역 의료 이미징 애플리케이션을위한 초음파의 광 검출기

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.