저자는 나라 바덴 - 뷔 르템 베르크와 Europäische 연합 (EU) - Europäischer Fonds 모피 다이 regionale Entwicklung 감사합니다 - 자금 ZAFH - 광자 N, 아니 기금 연구 기금에 대한 Bundesministerium 털 Bildung 숙녀 Forschung (BMBF)에. 1792C08뿐만 아니라 프로젝트 &quot;Aurami&quot;을 융자의 바덴 - 뷔 르템 베르크 - Stiftung GmbH가.

1. 셀 심는과 부화 <ol><li> 시드 개별 세포, 예를 들어 U373-MG 나 U-251-MG의 glioblastoma 세포 유리 슬라이드에 100 세포 / mm 2의 전형적인 밀도와 (예 : RPMI 1640 10% 태아 송아지 혈청 보충 문화 매체에서 4,872 시간을 위해 성장 37에서 보육을 사용하여 항생제) ° C 5 % CO 2. </li><li> 막 마커, 예를 들어 6 dodecanoyl-2-디메틸 아미노 8 μM (문화 매체)를 4 또는 세포질 표시의 농도에서 60 분 신청 나프탈렌 (laurdan)는, 예를 들어 calcein acetomethlyester은 40 분 신청과 함께 세포를 배양 4,5, 5 μM 3 또는 photosensitizer 관련된 멤브레인의 농도는, 예를 들어 protoporphyrin IX는 전구체 5 aminolevulinic 산 (1 MM 5 알라)는 4 시간의 부화에 유도. </li><li> 문화 중간이나 인산염으로 세포를 씻어 염분 (PBS)는 형광 현미경하기 전에 버퍼. &lt;이/ 리&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> 수직 현미경, 예를 Zeiss Axioplan를 사용하여 참조에 설명 된대로, 조명 장치에 의해 그것의 콘덴서를 교체하십시오. 헤미 - 구형 또는 광학 (그림 1 참조) 객체 슬라이드에 커플 링 된 헤미 - 원통형 유리 프리즘과 3. </li><li> 병렬 평형 레이저 빔을 사용하는 유리 프리즘 다시 추가로 광학 부품 (예 : 오목 거울) 샘플의 표면 (텔레 센 트릭 학생 선)에 평행 빔의 결과로 이미징 후. 전기장 벡터가 입사 평면에 수직 편광 것을 조심하고. </li><li> 샘플면에서 이미징 및 발생의 변수 각도 (개체 레이)에서 샘플을 조명하는 콘덴서 내부에 위치한 조절 미러를 사용합니다. 각 위치 입사 잘 정의 된 각도에 해당하는 곳 goniometric 측정 3 결정으로 조절 거울은, 단계 모터에 의해 구동 될 수있다 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. </li><li> 중요한 각도를 사용하여 조절 미러의 각도 위치를 보정 Θ C = 61.3 ° 고정 값으로 유리 물 전환을위한. Θ C는 형광 염료 (예 : 1 ㎜ 플라 빈의 mononucleotide, FMN)가 물에 용해되어 Θ의 변화에 따라 시각화 할 수 있습니다. 에서 거울의 위치 Θ = Θ C 미러 위치 프로그램에 저장됩니다. </li><li> 온도, 이득, 녹화 시간과 이동 속도를 포함하여 카메라의 매개 변수를 (다시 조명 ANDOR Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR 기술, 벨파스트, UK 6)으로 설정합니다. </li><li> 적절한 배율과 우선적으로 적당한 숫자 개구 (예 : 40 × / 0.75 또는 63 × / 0.90 물 침적)의 목적 렌즈를 사용하고 현미경의 객체 슬라이드를 현지화. 유리 프리즘과 샘플의 광학 접촉을 보장하기 위해 집중 오일을 사용합니다. 의 변화에​​ 따라 동일한 샘플의 형광 이미지를 기록조명의 각도 (Θ ≥ Θ C Θ와 C 셀 유리 인터페이스 64.5 °에 해당). 0.5 ° 또는 1 °의 단계를 66 ° -74 °의 각도 범위를 권장합니다. 형광 검출에 적합한 긴 패스 또는 밴드 패스 필터를 사용합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 다양한 각도 Θ뿐만 아니라 카메라 설정 (배경 차별에 대한), 여기 파장과 유리의 굴절 지수 (= 1.52 N 1) 셀에 기록 된 이미지를 (ASCII 형식으로 예를 들어) (N 2 = 1.37) 읽기 평가 프로그램에 (LabView, NanoCell). 에 대한 매개 변수 침투 깊이 D (Θ)와 전송 계수 T (Θ)의 각 집합이 자동으로 계산됩니다. </li><li> 수식 5 (막 마커) 또는 수식 4 (세포질 마커), inhomogeneous있는 개별 이미지에 따라 Δ 셀 기판 거리의 평가에 사용되는 이미지를 선택조명 (누설 E, G. 줄무늬)이 제외 될 수 있습니다. </li><li> 셀 기판 토폴로지의 이미지를 계산 및 디스플레이에 적합한 색상 코드를 선택합니다. 도 2에 도시로 개별 픽셀의 평가 프로파일 동안은 표시 할 수 있습니다. 이 프로필은 피팅의 품질에 대한 지표로 사용할 수 있습니다. </li><li> 평가 프로토콜을 저장합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 대표 실험은 친절 교수 월 Mollenhauer, 분자 종양학학과, 남부 덴마크 대학, 오덴세 (Odense)가 제공하는 유전 공학 U251-MG의 glioblastoma 세포를 수행하고 있습니다. 그 U251 세포의 두 subclones에서 종양 억제 유전자 TP53 또는 PTEN이 사용하는 오버 표현됩니다 Tet-에 inducible 표현 시스템이 세포가 감소 tumorigenic 잠재력을 전시하고 더 악성으로 간주 될 수 있다는 등.주세요 억제 유전자가없는 높은 악성 U251-MG 세포는 컨트롤로 사용하고, U251-아르MG 야생 형 세포는 더 비교 제공합니다. picosecond 펄스의 준 연속 시리즈 (; 391 나노 미터, 펄스 에너지 : 12 PJ, 반복 속도 : 파장 드라이버 PDL 800-B, Picoquant, 베를린, 독일과 LDH400 40 MHz의) 배출 레이저 다이오드는 여기 소스로 사용됩니다. 그림에서 활성 TP53 종양 억제 유전자로하고 laurdan (8 μM, 60 분)와 incubated U251-MG의 glioblastoma 세포의 3 TIRFM 이미지는 66.0 °의 입사 각도 69.0 °와 73.0 °의 침투 깊이에 해당하는에 그려져있다 약 140 nm의 사라져가는 전자기 분야, 75 nm의 60 nm의, 각각. 침투 깊이 형광을 감소와 함께 강도 감소 (비늘 참조) 세포의 더 많은 외면 사이트 (자신의 가장자리에 예를 들면 초점 연락처)에서 유래 된 것입니다. 셀 - 기판 거리가 (0-600 나노 미터 사이 인 색상 코드로 그림 3D로 시각화) 강력에 간 세포를 통해 다양통증이 몇 나노 미터 (흰색 - 노란색)과 250-300 nm의 (어두운 빨강), 즉 초점 연락처 및 큰 셀 기판 거리가 가까운 근처에 있습니다. 그림 4B, 셀 기판 거리가 U251-MG 제어 및 80-100 nm의 전형적인 값으로 야생 형 세포 (노란색에 오히려 상수를하는 동안 동일한 활성 억제 유전자 PTEN (그림 4D)와 U251-MG의 glioblastoma 세포에 대한 보유 )과 150-200 nm의 (오렌지 레드,도 4a). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> 그림 1. 직립 현미경의 VA-TIRFM을위한 조명 장치. 단계 모터에 의해 구동 조절 거울은 ± 0.25 °의 각도 해상도를 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> 한 PIX에 대한 그림 2. 평가의 프로필엘 (설계도). 언제 에선 [I F / T (Θ)]는 1 / D (Θ)의 함수로 도시된다, 경사가 셀 - 기판 거리 Δ를 나타냅니다. 이 경사는 일반적으로 약 정밀 ± 10 %로 결정된다. 한 값은 - inhomogeneous 조명으로 인한 - 표시 및 평가에서 제외되었습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> 그림 3 laurdan (8 μM, 60 분)와 부화시 활성 TP53 억제 유전자와 U251-MG의 glioblastoma 세포의 TIRFM 이미지를 표시합니다. 조명의 다양한 각도 (AC)로 기록, 0-600 nm의 범위에서 셀 기판 거리가 게재 391 나노 미터, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 : 여기 파장, 색상 코드 (D)에 의해. 210 μm × 210 μm은 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 4 색 코드에 의해 표시 0-600 nm의 범위에서 U251-MG의 glioblatoma 전지의 셀 - 기판 거리,. () 야생 유형 (B) 컨트롤, 활성 억제 유전자 TP53와 (C) 전지, (D) 활성 억제 유전자 PTEN과 세포, 여기 파장 : 391 nm의, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 :. 210 μm × 210 μm은 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

방법은 나노 미터 정밀도와 셀 기판 거리를 측정하기위한 설명되어 있습니다. 현재, 슈퍼 해상도 현미경의 방법은, 예를 들어 구조화 된 조명 7 일 또는 단일 분자 검출 8-10뿐만 아니라 자극 방출 고갈 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 현미경 11 상당한 관심을 끌 수있는을 기반으로합니다. 이러한 기술 중 어느 것도 그러나, 50 nm의 아래 축 해상도를 허용하지 않습니다...

굴절률 N (1)의 중간을 통해 확산 광 빔이 굴절률 N 2의 두 번째 중간에 인터페이스를 만났을 때 &lt;N 1, 총 내부 반사가 중요한 각도보다 큰 발생 Θ의 모든 각도에서 발생 Θ C = arcsin (N 2 / N 1). 완전히 반영되지에도 불구하고 입사 광 빔은 I에 따라 두 번째 매체와 인터페이스에서 수직 거리를 Z로 기하 급수적으로 쇠퇴에 침투 사라져가는 전자기 필드를 세상의 시작과 끝 (Z) = I 0 EZ / D (Θ). I (z는) 등으로 주어진 파장 λ의 침투 깊이로 전자 분야와 D (Θ)의 강도에 해당 D (Θ) = (λ/4π) (N 1 2 죄가 두 Θ - N 2 2) -1 / 2 문학 1,2에보고로서, 0 </sUB&gt;는 I 이메일이 전송 요소 T (Θ) 및 비율 N 2 / N 1 곱한 입사광의 강도에 해당합니다. 이 광 빔의 전기장 벡터가 입사 평면 (사건과 반사 빔이 사라지는 비행기 IE)에 편광 수직 인 경우,이 전송 요소가 주어집니다 T (Θ) = 4 왜냐하면이 Θ / [1 - (N 2 / NL 1) 2] TIRFM 측정에서 검출 된 형광 강도를 들어, 광 흡수는 시료의 모든 레이어를 통해 통합과 관련 염료의 형광 양자 수율 η로뿐만 아니라 감지 Ω의 고체 각도 곱해야합니다. 이전에 3보고,이 강도는에 의해 설명 될 수있다 I F (Θ) = (Θ) OC (Z) AT 전자 Z / D (Θ) dz 경우 독립적 인 F있는 모든 요소<html> fluorophores의 농도 C (Z)이 거의 일정으로 간주되는 경우 ROM이 입사 각도 Θ과 좌표 Z는 실험 상수 A. 방정식 3에서 포함되어 있습니다이 analytically 해결 될 수 - 중 모든 좌표 Z ≥ Δ에서 인터페이스에서 거리 Δ을 갖는 세포의 세포질 내에서 지정할 수있다. 이 경우 적분은 Z = Δ부터 Z = ∞ 결과 계산해야합니다 I F = C T (Θ) D (Θ) E-Δ / D (Θ) - 또는 Z 사이 = Δ - t / 2, Z = Δ + t / 2, 두께 t의 얇은 층 내에서 즉, 예를 들어 인터페이스에서 거리 Δ에있는 세포막. 이 경우 형광 강도는 다음과 같이 계산 될 수있다 I F = C T (Θ) 테-Δ / D (Θ), t는 Δ에 비해 작은 경우. 형광 강도 I F의 이미지가 변수 각도에 기록하는 경우 방정식 (4)와 (5) 셀 기판 거리에서 다닐 &quot;&gt;는 Δ는 계산 될 수있다 Θ 있으며, 경우 후면 (I F / T D) (Eq. 4) 또는 후면 (I F / T) (Eq. 5) 이러한 각도 1 / D의 함수로 계산됩니다.이 문서에 사용 된 막 마커 laurdan (S. 아래)에 대한 평가가 EQ 5.에 따라 수행되었다. 이전 3, 이미지 수집보고 및 평가가 필요로 - 샘플을 여기 빛의 균일 한 분배, - 2 층 모델 (기판과 세포질의 굴절 지수 N 1과 N 2, 각각)의 타당성. 플라즈마 막가 매우 얇은 경우이 보유하고 있으며, 세포 매체 (셀과 기판 사이)의 층은 입사광의 파장에 비해 작은 경우. 또한, 중간 수치 개구(일반적으로 ≤ 0.90) 현미경 대물 렌즈의는 유전체 인터페이스의 가까운 분야에서 방사선의 이방성에 의한 밝기의 편차를 방지하기 위해 바람직하다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 유형 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> 층류 </td><td> 안전 Holten </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> 재배 매체 </td></tr><tr><td> 유리 객체 슬라이드 </td><td> Marienfeld </td><td> 순수 흰색 유리 </td><td> 사용되는 특별한 청소 절차 </td></tr><tr><td> 6 - dodecanoyl-2-디메틸 아미노 나프탈렌 (laurdan) </td><td> 분자 프로브 </td><td></td><td> 형광 마커 (증권 솔루션 : 에탄올 2 ㎜) </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 칼 Zeiss </td><td> Axioplan 1 </tD&gt; <td></td></tr><tr><td> 레이저 다이오드 </td><td> PicoQuant </td><td> 드라이버 PDL 800-B와 LDH 400 </td><td> 파장 : 391 nm의 </td></tr><tr><td> 단일 모드 광섬유 시스템 </td><td> 포인트 소스 </td><td> kineFlex </td><td> collimating 광학와 함께 사용 </td></tr><tr><td> EMCCD 카메라 </td><td> ANDOR </td><td> DV887DC </td><td> 다시 조명 카메라 </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

표면 토폴로지, 기판에 성장 세포의 예는 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. 전지는 투명 슬라이드에 재배하고 homogeneously의 플라즈마 막에 배포 형광 마커와 incubated 수 있습니다. 조명이 사라져가는 전자기 필드의 다른 침투 깊이있는 총 내부 반사 (티르)의 변수 각도에 따라 병렬 레이저 빔에 의해 발생합니다. 10 다른 각도에서 조사시 형광 이미지의 기록은 몇 나노 미터의 정밀도로 셀 기판 거리를 계산 할 수 있습니다. 다양한 세포 라인, 예를 들어 암 세포의 정확성과 악성 세포 사이 접착력의 차이 따라서 결정됩니다. 또한, 화학 또는 photodynamic 치료시 세포 접착의 가능한 변경 사항은 검사를 할 수 있습니다. 슈퍼 해상도의 다른 방법에 비해 현미경 조명에 노출이 유지된다살아있는 세포의 아주 작은, 알 수없는 피해가 발생할 것으로 예상된다.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K 조회수.  Institut für Angewandte Forschung. 기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

비디오: Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

연구

생체공학

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...