CUBIC 전체 신장 3차원 염색

이 프로토콜을 사용하면 전체 신장에서 3차원 구조를 시각화할 수 있으며, 이는 거시적 관점을 제공하여 신장 연구에서 혁신적인 발견으로 이어질 수 있습니다. 전체 마운트 장기 염색은 항체 침투가 어렵기 때문에 어렵습니다. 이 프로토콜은 항체에 의한 신장의 고품질 전체 마운트 염색을 입증했습니다.

시작하려면 관류 고정 및 신장 샘플링 직후 신장을 섭씨 4도에서 16 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 담그어 침지 고정을 수행하십시오. PBS를 사용하여 각각 2 시간 동안 세 번 씻으십시오. 고정 된 신장을 14 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 50 % CUBIC-L의 7mm에 담그고 실온에서 부드럽게 흔들어 탈색 및 탈지방 과정을 수행하십시오.

6 시간 후, 신장을 14mm 둥근 바닥 튜브에 7 밀리리터의 CUBIC-L에 담그고 섭씨 37도에서 5 일 동안 부드럽게 흔 듭니다. CUBIC-L을 매일 새로 고칩니다. 탈색 및 탈지화가 완료되면 디스펜싱 스푼을 사용하여 샘플 취급을 하고 실온에서 2시간 동안 PBS로 신장을 세 번 세척합니다.

염색 완충액에 희석된 1차 항체에서 지방화된 신장을 면역염색하고, 섭씨 37도의 인큐베이터 쉐이커에서 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 그런 다음 PBST라고도 하는 PBS의 0.5% 트리톤 X-100으로 신장을 실온에서 하루 동안 세척합니다. 2 차 항체 염색의 경우, 어두운 곳에서 염색 완충액에서 2 차 항체로 신장을 섭씨 37도에서 7 일 동안 부드럽게 흔들어 치료하십시오.

PBST 세척으로 염색을 실온에서 하루 동안 고정한다. 고정 후 신장을 PB의 1 % 포름 알데히드에 3 시간 동안 담그고 실온에서 6 시간 동안 PBS로 씻습니다. 14 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 7 밀리리터의 50 % CUBIC-R +에 신장을 담그고 하루 동안 흔들어 굴절률 일치를 수행 한 다음 7 밀리리터의 CUBIC-R +로 2 일 동안 실온에서 흔들어 치료합니다.

면역 염색 방법의 도움으로 전체 신장의 교감 신경과 동맥을 3D 신장 영상으로 시각화했습니다. 또한, 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 재관류 손상 후에 시각화되었다. 이 프로토콜은 또한 전체 비장에서 교감 신경을 시각화하는 것을 용이하게했습니다.

3차원 면역형광염색을 위한 데이터 정량화 과정이 여기에 표시됩니다. 또한, 덕트, 근위 세뇨관의 S1 세그먼트 및 사구체를 수집하여 전체 신장에서 성공적으로 시각화했습니다. 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 약물 투여로 인한 억제된 사구체 비대도 3D 영상으로 시각화되었습니다.

이 프로토콜은 전체 신장 내의 특정 분자를 표시 할 수 있습니다. 따라서 연구자들은 혈관 구조의 구조 변화를 분석하거나 신장 조직에서 드문 사건을 발견 할 수 있습니다.